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國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布公告,，《中國(guó)藥典》2020年版第一增補(bǔ)本已編制完成,，將于2024年3月12日正式實(shí)施。本篇對(duì)生物制品新增指導(dǎo)原則中“9405 糖蛋白的糖基化分析指導(dǎo)原則”的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行梳理,，并為廣大客戶提供島津的應(yīng)對(duì)方案,。下圖為指導(dǎo)原則框架。

糖蛋白的糖基化是通過(guò)糖基受體,、糖基供體和糖基轉(zhuǎn)移酶三類分子的協(xié)同作用將單糖或寡糖以糖苷鍵形式連接在蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上,，是蛋白質(zhì)的一種翻譯后修飾。本指導(dǎo)原則闡述了糖蛋白糖基化分析的理念,、方法及應(yīng)用和驗(yàn)證的相關(guān)要求,。圖1為糖基化分析的決策框架圖。

糖基化分析流程通常為一個(gè)多步驟的過(guò)程,，必要時(shí)還需要進(jìn)行前處理（糖蛋白分離和純化）以去除干擾因素（如輔料,、鹽等）。按照完整糖蛋白分析、糖肽分析,、寡糖分析,、單糖分析等4種不同的互補(bǔ)分析方法，完成糖基化分析的全部流程,。糖蛋白N-糖基化和O-糖基化分析流程可參見圖2,。

下面具體考量幾種糖蛋白分析流程和方法。

1完整糖蛋白分析：提供關(guān)于糖蛋白糖基化分布等總體信息

1）  糖基化分布,、分子量：毛細(xì)管電泳法,、質(zhì)譜法

2）  糖基化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分子量遷移：聚丙烯酰胺凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法

3）  蛋白片段糖基化修飾：還原酶解后質(zhì)譜分析法

4）  唾液酸修飾程度：高效液相色譜法、離子色譜法,、等電聚焦電泳法,、毛細(xì)管電泳法

應(yīng)用案例1：完整糖蛋白分子量分析

2糖肽分析：提供特定糖基化位點(diǎn)的糖基化類型、占有率,、寡糖結(jié)構(gòu)信息

1）  糖肽富集或分離：反相/親水高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法

2）  糖基化位點(diǎn)及糖肽結(jié)構(gòu)：質(zhì)譜法

3）  寡糖分子量,、位點(diǎn)占有率：質(zhì)譜法

應(yīng)用案例2：糖肽結(jié)構(gòu)分析

3寡糖分析：提供多種寡糖類型的結(jié)構(gòu)以及相對(duì)含量的信息

1）  非衍生寡糖的分離與分析：高效陰離子色譜法,、多孔石墨化碳色譜法、質(zhì)譜法

2）  衍生寡糖的分離與分析：色譜法,、毛細(xì)管電泳法,、質(zhì)譜法（熒光標(biāo)記衍生、紫外標(biāo)記衍生,、全甲基化衍生）

應(yīng)用案例3：2-AB標(biāo)記的N糖分析

4單糖分析：提供單糖鑒別,、含量及單糖組成信息

1）  非衍生單糖的分離與定量分析：比色法、高效陰離子色譜法,、多孔石墨化碳色譜法,、質(zhì)譜法

2）  衍生單糖的分離與定量分析：反相色譜法、離子交換色譜法,、氣相色譜法,、毛細(xì)管電泳法、熒光或紫外檢測(cè)法

應(yīng)用案例4：抗體中唾液酸測(cè)定

中國(guó)藥典2015版和2020版提出了糖基化的重要性,，有部分具體方法,，但缺乏糖基化分析指導(dǎo)原則。本新增指導(dǎo)原則從完整糖蛋白分析,、糖肽分析,、寡糖分析、單糖分析4個(gè)方面詳細(xì)收載了前處理方法及檢測(cè)方法,，指導(dǎo)如何選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿闪己玫奶腔治?。島津不斷開發(fā)新方法,，持續(xù)推出滿足藥典指導(dǎo)原則的應(yīng)用方案。

注：完整應(yīng)用報(bào)告請(qǐng)掃描下方二維碼獲取,。

1臺(tái)式 MALDI-TOF MS 應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)分子量測(cè)定

2 MALDImini應(yīng)用于糖肽分析

3利用Q-TOF結(jié)合熒光檢測(cè)器分析2-AB標(biāo)記N糖

4生物藥中寡糖評(píng)估方法的介紹

5超高效液相色譜法用于抗體中唾液酸的測(cè)定

6 LCMS用于抗體中唾液酸的測(cè)定    

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