背景介紹

2022年8月1日,，由國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布YY/T 1805.3-2022《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白 第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)療器械行業(yè)標準正式實施。該標準適用于組織提取純化的膠原蛋白及其膠原類產(chǎn)品中不同類型膠原蛋白特征多肽含量的測定,，并規(guī)定了液相色譜-質(zhì)譜法測定不同類型膠原蛋白特征多肽含量的方法。該標準由全國外科植入物和矯形器械標準化技術(shù)委員會組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會（SAC/TC110/SC3）歸口，島津中國創(chuàng)新中心使用LCMS-8050參與了新標準的研制和驗證工作,，助您一起輕松應(yīng)對新標準的應(yīng)用。

膠原蛋白檢測新標準來襲,，您準備好了么,？

標準解讀

膠原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性和弱抗原性,，成為應(yīng)用最為廣泛的生物材料之一,。膠原蛋白產(chǎn)品屬于大分子，可用液相色譜法,、MALDI質(zhì)譜法,，凝膠電泳法對其整體性能進行表征。但不同動物來源及不同類型的膠原蛋白的結(jié)構(gòu),、分子量,、等電點等理化性質(zhì)較為相似，上述傳統(tǒng)方法對膠原內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的變化識別能力有限,，無法實現(xiàn)膠原類別的精準鑒別,。本標準基于液相色譜質(zhì)譜特征多肽法可實現(xiàn)不同動物來源不同類型的膠原蛋白的定性和定量檢測，為膠原蛋白產(chǎn)品的定性及純度判別提供了依據(jù),。膠原蛋白是大分子纖維狀蛋白,，具有三螺旋結(jié)構(gòu),，本標準采用熱變性處理使其三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并溶解，胰蛋白酶酶解后對不同類型膠原的特征肽進行檢測,。為了減少質(zhì)譜分析時基質(zhì)的干擾并提高方法的準確性,，本標準采用內(nèi)標法進行定量。

本標準的頒布對不同類型膠原產(chǎn)品進行精準鑒別,、規(guī)范動物源膠原的監(jiān)管,、提高膠原產(chǎn)品的理化表征能力和生物安全性等方面具有深遠的意義。

圖1.《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白

第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白

含量檢測 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)藥行業(yè)標準發(fā)布稿

特征多肽法的原理：篩選已知序列目標蛋白中*且穩(wěn)定存在的肽段,，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測該肽段含量從而推算目標蛋白的含量,。該方法通常使用胰蛋白酶特異性地酶解精氨酸和賴氨酸的C末端，生成具有堿性氨基酸末端的多肽,，因此具有較強的方法專屬性和檢測靈敏度,。目前特征多肽法已成功應(yīng)用于膠類中藥的真?zhèn)舞b別，食品中過敏原的檢測以及乳品中A2 β-酪蛋白的含量測定等工作中,。

島津解決方案

島津三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LCMS-8050采用全新設(shè)計的加熱ESI源和新型碰撞池UFsweeperⅢ,，大幅提高了靈敏度。在確保數(shù)據(jù)準確度和精度的同時,，LCMS-8050可實現(xiàn)555 ch/sec的高速MRM采集和5 msec的正負極性切換,。即便對于未*分離的色譜峰，LCMS-8050也可實現(xiàn)定量離子,、參比離子和內(nèi)標離子充分的采集,。

Skyline軟件是由西雅圖華盛頓大學(xué)的MacCoss團隊開發(fā)的一款蛋白質(zhì)靶向分析的專業(yè)軟件，實現(xiàn)了從蛋白質(zhì)到多肽再到MRM離子對檢測列表的轉(zhuǎn)化,。其獨特的保留時間預(yù)測功能以及碰撞能量預(yù)測功能使得多肽分析方法的開發(fā)變得更加便捷。島津LabSolutions工作站與Skyline軟件無縫銜接,，是靶向蛋白質(zhì)定量方法開發(fā)的得力工具,。

分析儀器

表1. 豬I型膠原蛋白特征多肽MRM檢測參數(shù)

*定量離子對

豬I型膠原蛋白特征多肽對照品的典型色譜圖見圖2，二級質(zhì)譜圖見圖3,。

圖2. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對照品典型色譜圖

圖3. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對照品典型二級質(zhì)譜圖

結(jié) 論

膠原基生物材料中膠原蛋白的含量檢測是膠原蛋白制品品質(zhì)評價,，工藝穩(wěn)定性評價的重要要素。豬I型膠原海綿是一種重要的醫(yī)用膠原制品,，其主要成分豬I型膠原蛋白分子量逾40萬,，液質(zhì)聯(lián)用儀無法直接檢測。本方法采用碳酸氫銨水溶液稀釋并使用胰蛋白酶酶解,。通過檢測豬I型膠原特征肽的含量,，折算出膠原海綿中豬I型膠原蛋白的含量。本法具有前處理操作簡便,，方法特異性好,，精密度高等優(yōu)點,，方法穩(wěn)定可靠，可在膠原醫(yī)療器械產(chǎn)品檢測領(lǐng)域推廣,。

-參考文獻 -

《YYT 1805.3-2022 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品

膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白

含量檢測——液相色譜-質(zhì)譜法》