質(zhì)譜成像技術(shù)揭示板藍根中化學(xué)成分的空間分布

板藍根（Isatidis Radix）為十字花科菘藍屬植物菘藍（Isatis indigotica Fortune）的干燥根,，具有清熱,、解毒,、涼血,、利咽等功效,。作為清熱解毒類的代表藥物,，板藍根與廣泛用于各類感冒的預(yù)防和治療，在嚴重急性呼吸綜合征（SARS）,、甲型H1N1流感等疾病的防治中發(fā)揮了積極作用,。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發(fā)以來，各版《診療方案》和“三藥三方”中也不乏板藍根的身影,。板藍根的抗病毒抗炎藥效顯著,，但化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量評價難度較高,，因而一直是國內(nèi)外研究的熱點,。

目前研究學(xué)者已經(jīng)從板藍根中分離得到近400個化合物，綜合文獻報道主要可歸納為生物堿,、含硫化合物,、苯丙素、核苷,、氨基酸,、有機酸、酚,、黃酮,、蒽醌、萜,、醇,、醛、酮,、腈,、酯、糖,、甾醇,、肽、鞘脂等19大類,。研究藥用植物化學(xué)成分的空間分布,，有助于了解其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和功能。盡管板藍根的化學(xué)成分研究已經(jīng)十分深入,，但其分子空間分布鮮見報道,。質(zhì)譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)是近年新興的分子成像技術(shù),，通過直接測定樣品表面的離子信號獲得其空間分布信息,，具有非靶向、無需標記和多成分同時檢測的優(yōu)勢,。與光學(xué)圖像采集技術(shù)結(jié)合后,，既可觀察到高分辨率的形態(tài)圖像,，又可對特定的分子進行鑒定和可視化分布分析，在生命科學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景,。本文采用高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)對板藍根化學(xué)成分的空間分布進行分析,。利用大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸電離-離子阱-飛行時間質(zhì)譜（atmospheric pressure matrix assisted laser desorption combined with ion trap-time-of-flight mass spectrometry，AP-MALDI-IT-TOF/MS）掃描不同產(chǎn)地藥材橫切面,，鑒定所含化合物,，并觀察化合物空間分布模式和富集位置，結(jié)合偏最小二乘回歸（partial least squares regression,，PLSR）算法,，對不同樣品進行分類。研究思路見圖1,。

圖1 AP-MALDI-IT-TOF/MS成像技術(shù)揭示板藍根中化學(xué)成分的空間分布

1. iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡測試條件

質(zhì)譜成像技術(shù)在植物,、動物、人體組織中的內(nèi)源性成分和藥物代謝組分的可視化檢測方面發(fā)展迅猛,，但在中藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用才剛開始起步,，且多用于新鮮采集的原植物或中藥材。而真正用于市場流通和臨床應(yīng)用的中藥材為干品,，制備滿足MSI測試需要的切片比較困難,，故相關(guān)研究鮮見報道。在制備板藍根干品冰凍切片時,，其干燥,、堅硬、易碎的結(jié)構(gòu)帶來了極大的挑戰(zhàn),，故對冷凍切片的厚度,、溫度，切片固定方式,，基質(zhì)種類和添加方式等進行了詳細的優(yōu)化,。板藍根藥材經(jīng)明膠包裹冷凍后，先用雙面碳導(dǎo)電膠貼牢后,，再用冰凍切片機切制40 μm的組織切片,，分別噴涂2, 5-DHAP溶液和1, 5-DAN溶液作為正、負離子的基質(zhì),。主要質(zhì)譜條件如下：激光照射直徑：40 μm,，像素間隔80 μm，掃描范圍：m/z 100-500,，m/z 500-1000。

2. 板藍根中化合物的AP-MALDI-IT-TOF MSI可視化分布

根據(jù)離子的準確質(zhì)荷比,、同位素豐度比,，與對照品和液質(zhì)一,、二級數(shù)據(jù)比對，并結(jié)合文獻檢索和數(shù)據(jù)庫搜查,，初步鑒定了多個化合物類別118個質(zhì)譜峰（見圖2）,。成像質(zhì)譜顯微鏡將光學(xué)顯微鏡和質(zhì)譜儀的優(yōu)勢整合，既可觀察到形態(tài)圖像,，又可對分子進行鑒定和可視化分布分析,，在軟件上可簡便且高精度地重疊觀察光學(xué)顯微鏡圖像與質(zhì)譜分析圖像，詳細解析感興趣區(qū)域,。本文采用AP-MALDI-IT-TOF MSI技術(shù)揭示了板藍根中化合物的空間分布,， 圖3和 圖4展示了板藍根橫切面的木栓層、皮層,、韌皮部,、形成層、木質(zhì)部及部分化合物在特定空間區(qū)域的分布,。綜合分析,，板藍根中化合物大多富集于營養(yǎng)儲存的組織韌皮部，與之相比,，水分輸送組織木質(zhì)部中集中分布的成分較少,。

圖2 板藍根MALDI-IT-TOF MS成像化合物鑒別結(jié)果

圖3 板藍根橫切面光學(xué)圖 (a) 和oxindole (b)、3-[2'-(5'-hydroxymethyl) furyl]-1(2H)-isoquinolinone-7-O-β-D-glucoside (c),、coniferin (d),、guanine (e)、histidine (f),、 proline (g),、arginine (h)、cyclo(L-Phe-L-Tyr) (i)等成分正離子質(zhì)譜成像圖

圖4 板藍根橫切面光學(xué)圖 (a) 和 isatindigoside F (b),、clemastanin B (c),、maleic acid (d)、malic acid (e),、citric acid (f),、sucrose (g)、isovitexin (h),、vanillin (i) 等成分負離子質(zhì)譜成像圖

3. PLSR法區(qū)分不同產(chǎn)地板藍根藥材

將4個產(chǎn)地的各3批板藍根藥材分別劃分到4個組,。以樣品橫切面的AP-MALIDI-IT-TOF MSI數(shù)據(jù)為Y值，組別為X值,，在正,、負離子模式和m/z 100-500、m/z 500-1000兩個掃描范圍內(nèi)，分別建立PLSR回歸模型,。由圖5可見,，在4個模型中，樣品規(guī)格的預(yù)測值和實際值均呈現(xiàn)良好的相關(guān)關(guān)系,，說明采用PLSR法可對不同產(chǎn)地的板藍根進行準確的區(qū)分,。

圖5 MALDI-IT-TOF MS成像結(jié)合PLSR回歸區(qū)分不同產(chǎn)地板藍根樣品

正離子m/z 100-500范圍 (A)、負離子m/z 100-500范圍 (B),、正離子m/z 500-1000范圍(C),、負離子m/z 500-1000范圍 (D)

本文相關(guān)內(nèi)容由中國食品藥品檢定研究院的聶黎行研究員提供，詳細研究內(nèi)容已正式發(fā)表于Frontiers in Pharmacology - Ethnopharmacology, 2021, https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685575,。

文獻題目

《Microscopic Mass Spectrometry Imaging Reveals the Distributions of Phytochemicals in the Dried Root of Isatis indigotica》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Li-Xing Nie1,2, Jing Dong3, Lie-Yan Huang2, Xiu-Yu Qian2, Shuai Kang2,4*, Zhong Dai2 and Shuang-Cheng Ma1,2*

1 Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing, China

2 National Institutes for Food and Drug Control, National Medical Products Administration, Beijing, China

3 Shimadzu China Innovation Center, Beijing, China

4 College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, China