RNA酶保護(hù)試驗方法
RNA酶保護(hù)法是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交,，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結(jié)合,，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA,，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實驗,。
目錄
· 一,、 RNA酶保護(hù)試驗的介紹
· 二、試劑準(zhǔn)備
· 三、操作步驟
· 四,、電泳與放射自顯影
· 五,、注意事項
· 六、技術(shù)文檔
RNA酶保護(hù)試驗是通過液相雜交的方式,，用反義RNA探針與樣品雜交,，以檢測RNA表達(dá)的技術(shù)。
一,、 RNA酶保護(hù)試驗的介紹
RNA酶保護(hù)試驗（RNase Protection Assay,，RPA） 是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交,，以檢測RNA表達(dá)的技術(shù),。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：
1. 檢測靈敏度比Northern雜交高,。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失,，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳,，故損失小,，提高了靈敏度。
2. 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺"問題,，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降,，而RPA沒有擴(kuò)增過程，因此,，分析的數(shù)據(jù)真實性較高,。
3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此,，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析,。
4.步驟較少，耗時短,。與Northern雜交相比,，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。
5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高,，無探針自身復(fù)性問題,，無須封閉。
6. 一個雜交體系中可同時進(jìn)行多個探針雜交,，無競爭性問題,。
7. 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大,。
RPA的缺點是需要同位素標(biāo)記探針,。
二,、試劑準(zhǔn)備
1. GACU POOL：取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl,。
2. 雜交緩沖液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml,，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.RNase A（10mg/ml） 8μl.RNase T1（250U/μl） 1μl,，加DEPC H2O至2ml
三,、操作步驟
（一） 反義RNA制備
可由含T7或SP6啟動子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產(chǎn)物為模板制備,，本文介紹后者,。
1.設(shè)計含T7啟動子的PCR引物
由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列: T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物設(shè)計的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計相同,。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度,，具體設(shè)計時可考慮100-400bp長。采用巢式PCR,，即先擴(kuò)增出一較長的片段,，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性,，如下圖所示
2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR,，再以PCR 產(chǎn)物為模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR,。
3.探針合成標(biāo)記與純化
在0.5ml 離心管中加入下列試劑：
RNasin （40U/μl） 0.5μl
GACU POOL GAC
（含GTP.CTP.ATP各2.75 mM,，UTP 61μM） 2μl
[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μl
DTT （二硫蘇糖醇，0.1M） 1μl
5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl
模板（50ng/μl） 1μl
T7 RNA 聚合酶 （15U） 1μl
混合后,，短暫離心,，37℃保溫1hr。
加入DNaseⅠ（10U/μl） 1μl,， 37℃ 15min,， 然后75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：飽和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA（2μg/μl） 4μl
DEPC H2O 100μl
室溫下充分混勻,，離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中,，加入100μl氯仿,，混勻，離心10000g×2min,。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中,，再加入3M NaAc 10μl，預(yù)冷無水乙醇250μl,，混勻后,，-20℃靜置30min,。4℃離心13500g×10min。棄上清液,，沉淀用75%乙醇100μl洗滌,，4℃離心13500g×2min， 棄上清液,。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇,。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用,?？捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。
（二） 雜交
1.RNA提取后溶解在雜交緩沖液中,，濃度為1μg/μl,。
2.取8μl RNA加入1-3μl探針（根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整） 于0.5ml 離心管中。
3.80℃保溫2min,，然后40-45℃下雜交12-18hr,。
（三） 消化
1.雜交管于37 ℃保溫15min，加入RNase消化液,，37 ℃保溫30min,。
2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻,，37 ℃保溫10min,。
3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻,，室溫離心,，10000g×2min。
4.轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中,，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl,，再加入200μl異丙醇，混勻后,，置-20℃ 30min,，4 ℃離心，135000g×10min,。
5.棄上清液,，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀,。
四,、電泳與放射自顯影
（一） 配制凝膠：（50ml）
40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl,，混勻,，注入電泳槽中,，插入梳，待膠凝固,。
（二） 預(yù)電泳（50ml）
以1×TBE為上下槽電泳緩沖液,，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測序電泳裝置,，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上,，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50 ℃,。待膠板溫度達(dá)50 ℃時,，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣,。
（三） 加樣
將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 ℃加熱2min,，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr,。（電泳條件同預(yù)電泳） ,。
（四） 電泳結(jié)束
電泳結(jié)束后，打開膠板,，用濾紙取下膠,，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中,，暗室紅光下,，壓上一張X片，蓋上暗盒,，-70℃曝光1-3天,。暴光結(jié)束后，將X光片顯影.定影.水洗.晾干,。
五,、注意事項
1.本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染,。
2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA,，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化,，因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段,。因此進(jìn)行PCR時，采取盡量減少錯配的措施,。
3.同位素對RNA合成有一定影響,，有時會產(chǎn)生非全長的探針,。因此,，標(biāo)記時間不宜過長,。
4.RNase消化液有時會產(chǎn)生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用
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