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熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)步驟

儀器設(shè)備
    1、 醫(yī)用微波爐,；
     2,、 水浴鍋,；
     3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡,；
     4,、 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機(jī)。

FISH試劑
    （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成,，儲(chǔ)存于4℃,；
     （2）20×SSC（pH7.0）；
     （3）2×SSC,，由20×SSC溶液稀釋而成,；
     （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
     （5）變性液(70％甲酰胺+2×SSC,，pH7.0)：4ml 20×SSC,；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺,。每次新鮮配制,。
     （6）雜交后洗滌液： 20×SSC 4ml；蒸餾水16ml,；甲酰胺20ml,。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫,。

實(shí)驗(yàn)步驟
    1,、脫蠟：
     1）二甲苯脫蠟3次，每次5min,；
     2）100％酒精兩次,，每次2min；
     3）移出酒精,，斜置切片,，標(biāo)記末段向下，空氣干燥,。
    2,、蛋白酶處理:
     1）每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管,，在水浴槽中預(yù)熱,。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動(dòng)直到酶溶解,。
     2） 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液,。37℃孵育20min。
     3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次,，每次1min,。
     4）梯度酒精脫水（-20℃預(yù)冷）,。
    3、變性：
     1）每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液,；
     2）78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；
     3）78℃孵育8min,；
     4） 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min,，再依次移入80%、90%和的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi),，每缸2min,；
     5）空氣干燥。
    4,、雜交：
     1）準(zhǔn)備探針,；
     2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片,；
     3）滴10μl探針在切片的組織上,，加蓋玻片；
     4）蓋上濕盒蓋,，37℃孵育12h～16h,。
     雜交后的水洗：
     5）鑷子小心去除蓋玻片；
     6）43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min,；
     7）2×SSC(37℃)洗兩次,，每次10min；
     8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測(cè),，勿使切片干燥,。
     檢測(cè)：
     9）從1×PBS中取出切片，除去過(guò)多的水分,，避免標(biāo)本干燥,。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片,。
    
     11）去掉塑料蓋膜,，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,，每次2min,。
擴(kuò)增：
     12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出,；
     13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體,，加塑料蓋膜，室溫孵育20min,；
     14）去掉塑料蓋膜,，把切片放人含1×PBS的染色缸,。1×PBS室溫下洗3次，每次2min,；
     15）從1×PBS中取出切片,，斜置切片使液體排出；
     16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體,，加塑料蓋膜,，室溫孵育20min；
     17）1×PBS室溫下洗3次,，每次2min,。
    5、細(xì)胞核染色：
     1）張切片加10μl～20μl DAPI,，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml,；
     2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察,。

PRINS步驟
    1,、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS；
    2,、用0.2mol/L鹽酸處理5min,；
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min,；
    4,、分別用80％，95％和100％酒精脫水,，室溫干片,；
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,，50mmol/L KCl,，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP,，dCTP,，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,，引物250ng,，Taq DNA聚合酶2U)，加蓋片,；
    6,、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min；
    7,、用0.1×SSC液,，65℃洗5min,；
    8、片于65℃ 10s～20s,；用4×SSC-0.1％吐溫20液42℃洗5min,，2次；
    9,、經(jīng)Buffer I液洗后滴加20％羊血清封閉30min,；
    
    11、BufferⅢ液洗5min,；
    12,、用BCIP-NBT顯色1h～2h,，在鏡下控制,，終止顯色；
    13,、用中性紅或核固紅襯染,，酒精脫水，二甲苯透明,，樹(shù)脂封片,。