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上海申知心生物科技有限公司

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熒光原位雜交步驟

2015-5-11  閱讀(1414)

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【詳細(xì)說(shuō)明】


熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)步驟

儀器設(shè)備
    1、 醫(yī)用微波爐,;
     2,、 水浴鍋,;
     3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡,;
     4,、 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機(jī)。

FISH試劑
    (1)1×PBS:由10×PBS溶液稀釋而成,,儲(chǔ)存于4℃,;
     (2)20×SSC(pH7.0);
     (3)2×SSC,,由20×SSC溶液稀釋而成,;
     (4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
     (5)變性液(70%甲酰胺+2×SSC,,pH7.0):4ml 20×SSC,;8ml蒸餾水;28ml甲酰胺,。每次新鮮配制,。
     (6)雜交后洗滌液: 20×SSC 4ml;蒸餾水16ml,;甲酰胺20ml,。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫,。

實(shí)驗(yàn)步驟
    1,、脫蠟:
     1)二甲苯脫蠟3次,每次5min,;
     2)100%酒精兩次,,每次2min;
     3)移出酒精,,斜置切片,,標(biāo)記末段向下,空氣干燥,。
    2,、蛋白酶處理:
     1)每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,,在水浴槽中預(yù)熱,。將消化酶液加入管內(nèi),搖動(dòng)直到酶溶解,。
     2) 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液,。37℃孵育20min。
     3) ×SSC在室溫下漂洗切片3次,,每次1min,。
     4)梯度酒精脫水(-20℃預(yù)冷),。
    3、變性:
     1)每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液,;
     2)78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸;
     3)78℃孵育8min,;
     4) 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min,,再依次移入80%、90%和的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi),,每缸2min,;
     5)空氣干燥。
    4,、雜交:
     1)準(zhǔn)備探針,;
     2)取一個(gè)較大的濕盒,交叉放置切片,;
     3)滴10μl探針在切片的組織上,,加蓋玻片;
     4)蓋上濕盒蓋,,37℃孵育12h~16h,。
     雜交后的水洗:
     5)鑷子小心去除蓋玻片;
     6)43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min,;
     7)2×SSC(37℃)洗兩次,,每次10min;
     8)切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測(cè),,勿使切片干燥,。
     檢測(cè):
     9)從1×PBS中取出切片,除去過(guò)多的水分,,避免標(biāo)本干燥,。把切片放入濕盒內(nèi),同時(shí)處理4張切片,。
    
     11)去掉塑料蓋膜,,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,,每次2min,。
擴(kuò)增:
     12)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出,;
     13)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,,加塑料蓋膜,室溫孵育20min,;
     14)去掉塑料蓋膜,,把切片放人含1×PBS的染色缸,。1×PBS室溫下洗3次,每次2min,;
     15)從1×PBS中取出切片,,斜置切片使液體排出;
     16)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,,加塑料蓋膜,,室溫孵育20min;
     17)1×PBS室溫下洗3次,,每次2min,。
    5、細(xì)胞核染色:
     1)張切片加10μl~20μl DAPI,,覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5ml,;
     2)盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察,。

PRINS步驟
    1,、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS;
    2,、用0.2mol/L鹽酸處理5min,;
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min,;
    4,、分別用80%,95%和100%酒精脫水,,室溫干片,;
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,,50mmol/L KCl,,1.5mmol/L MgCl2,各加200μmol/L dATP,,dCTP,,dGTP,1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,,引物250ng,,Taq DNA聚合酶2U),加蓋片,;
    6,、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min;
    7,、用0.1×SSC液,,65℃洗5min,;
    8、片于65℃ 10s~20s,;用4×SSC-0.1%吐溫20液42℃洗5min,,2次;
    9,、經(jīng)Buffer I液洗后滴加20%羊血清封閉30min,;
    
    11、BufferⅢ液洗5min,;
    12,、用BCIP-NBT顯色1h~2h,,在鏡下控制,,終止顯色;
    13,、用中性紅或核固紅襯染,,酒精脫水,二甲苯透明,,樹(shù)脂封片,。




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