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傳代培養(yǎng)操作步驟：

一,、貼壁培養(yǎng)

細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

（1）傳代前在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長密度,，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%~90%時,，即可進(jìn)行傳代。

（2）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液,。加入PBS清洗1~2次,，左右輕輕搖晃后棄掉,。

（3）根據(jù)培養(yǎng)瓶大小向瓶內(nèi)加入適量含EDTA的，一般應(yīng)覆蓋整個培養(yǎng)瓶底,。

（4）把培養(yǎng)瓶放入37℃ CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行消化,，2~5min后拿出放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有70%~80%細(xì)胞收縮變圓,、細(xì)胞間隙變大時,，再輕輕拍打培養(yǎng)瓶使剩余細(xì)胞脫落，然后立即加入2倍量的培養(yǎng)液中止消化,，使用吸頭輕輕吹打,，混合均勻，以防消化過度,。

（5）吸出所有細(xì)胞懸液至離心管內(nèi),，1000rpm/min離心3~5min。

（6）棄上清,，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻,，使細(xì)胞均勻分散,。

（7）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)足培養(yǎng)液,，搖勻，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),。

（8）根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)確定換液或傳代時間,，甚至進(jìn)行細(xì)胞凍存。

calu-6人退行性癌細(xì)胞

細(xì)胞基本屬性：

細(xì)胞詳細(xì)介紹：

二,、懸浮細(xì)胞

傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

一般實驗室中懸浮細(xì)胞傳代方法分為直接傳代法和離心傳代法（培養(yǎng)液中含有細(xì)胞碎片的情況下）。當(dāng)在顯微鏡下觀察到懸浮細(xì)胞已經(jīng)長滿至80%~90%（細(xì)胞懸液變黃）時,，即可進(jìn)行傳代,。

（1）嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，所用一切試劑及耗材均應(yīng)無菌,，且須在無菌超凈工作臺中紫外照射30min以上,，以免細(xì)胞發(fā)生污染。

（2）所用培養(yǎng)液必須適宜細(xì)胞生存和生長,。來源于不同動物種類,、組織類型的細(xì)胞，對培養(yǎng)液的要求不一樣,，必要時可用預(yù)實驗的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液,。

（3）胎牛血清對于維持細(xì)胞生存，促進(jìn)細(xì)胞生長起著關(guān)鍵作用,?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)或預(yù)實驗選擇合適的胎牛血清。一旦確定,，就應(yīng)保持用至實驗完成,。

（4）消化細(xì)胞時應(yīng)避免消化時間過短導(dǎo)致消化不收集到的細(xì)胞數(shù)量少，或消化時間過長導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)塊樣絮狀游離,，這時的細(xì)胞已有損傷或死亡,，影響細(xì)胞數(shù)量和實驗進(jìn)度。

（5）細(xì)胞離心的時候應(yīng)避免離心力過小收集的細(xì)胞數(shù)量不夠,，或離心力過大對細(xì)胞產(chǎn)生損傷,。離心后的細(xì)胞沉淀棄去上清后，應(yīng)先彈散細(xì)胞沉淀,，再加入培養(yǎng)液重懸,，這樣比直接吹打?qū)?xì)胞損傷小,，可以提高細(xì)胞活率。

（6）吹打細(xì)胞時應(yīng)盡量避免細(xì)胞的產(chǎn)生,，以免損傷細(xì)胞,，影響細(xì)胞狀態(tài)（吹打過程中殘留部分液體在吸頭內(nèi)可以減少氣泡的產(chǎn)生）。

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