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明膠酶譜分析ELISA試劑盒為什么老出不了條帶,，看過來！

很多老師反應(yīng)在操作明膠酶譜試劑盒的時(shí)候,，有時(shí)候很難出現(xiàn)漂亮的條帶,，小編為您答疑解惑！

1.樣本失活

2.電泳操作不對(duì),，配膠不均,，有氣泡，溫度控制不當(dāng)?shù)取?/p>

3.孵育時(shí)間不夠,。由于某些樣本活性太低,，孵育時(shí)間不夠，很難出現(xiàn)漂亮的條帶,。

明膠酶譜分析試劑盒檢測步驟：

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%,。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠,。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合,。

2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),，混合后直接上樣。切勿加熱變性,，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液,。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可,。陽性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠,、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,，取5-15μl 上樣。

3 低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為20 mA/gel,。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠,，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘,。中間換液,。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí),。陽性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低,，應(yīng)延長孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜,。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）,。凝膠的大部分區(qū)域被深染,，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。陽性對(duì)照將在66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9),、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶,。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,，但凝膠背景并非真正全黑,。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,，并盡量設(shè)置為黑色,。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式,。