1、預變性--模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要,，建議加熱時間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘,。
2、循環(huán)中的變性步驟--循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可縮短該步驟時間,，變性時間過長損害酶活性,，過短靶序列變性不*，易造成擴增失敗,。
3,、引物退火--退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實驗基礎上做出預估?！ ⊥嘶饻囟葘CR的特異性有較大影響,。
4,、引物延伸--引物延伸一般在72℃進行（Taq酶zui適溫度）,。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略 延伸時間隨擴增片段長短而定,，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp,。
5,、循環(huán)數(shù)--大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴增,。
6,、zui后延伸--在zui后一個循環(huán)后,，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈,。
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