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詳細介紹
SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白,！
在不使用放射性同位素的情況下，利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白,。分離后的凝膠可用于蛋白質(zhì)印跡和質(zhì)譜分析等后續(xù)實驗,。
Phos-tag™ SDS-PAGE操作簡單，只需在常規(guī)SDS-PAGE膠中加入Phos-tag™ Acrylamide 和二價錳離子或者鋅離子即可進行實驗,。在電泳過程中,，磷酸化蛋白的磷酸基團與Phos-tag™中的二價金屬離子相結(jié)合，降低其遷移速度,，從而可區(qū)分磷酸化與非磷酸化蛋白,。
◆原理
◆優(yōu)點、特色
● 采用Phos-tag™ SDS-PAGE可輕松分離磷酸化蛋白
無任何放射性元素及化學標記,！
● 可檢測不同磷酸化水平的磷酸化蛋白
無需任何磷酸化抗體,！
● 適用于內(nèi)源性蛋白的磷酸化分析！
◆案例,、應用
【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】
我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學研究院醫(yī)學研究科 小川覺之
Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發(fā)出來的試劑,。此產(chǎn)品使用方便，不但可用于體外實驗,，還能定量分析體內(nèi)蛋白的磷酸化水平,。可用于常規(guī)電泳實驗,，無需購買特殊設備,，性價比高。傳統(tǒng)蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體,、RI 等其它試劑,，操作復雜，花費大,，且放射性元素會有安全隱患,，而Phos-tag ™ 的出現(xiàn)恰恰可以彌補這些缺點,，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖
Lane 1 為非磷酸化蛋白,，Lane 2-5 為磷酸化蛋白,，各蛋白因磷酸化狀態(tài)不同而條帶遷移率也有所不同。
磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數(shù)量比,、磷酸化程度,、磷酸化蛋白的豐度等都可根據(jù)條帶遷移和條帶濃度求得。
【資料提供】
日本東京大學研究生院醫(yī)學系研究科
【二維電泳中的應用：分析hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體】
小鼠巨噬細胞J774.1 經(jīng)LPS 刺激后,，裂解細胞,，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中,，一維是IPG 膠,，二維是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離hnRNP K 的異構(gòu)體,。利用質(zhì)譜儀,，可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。
二維電泳
同一個等電點的位置上,，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學 生命納米系統(tǒng)科學研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學專業(yè) 木村彌生,、平野久理化學研究所RCAI 小原收
【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】
常規(guī)SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實驗分析EGF 刺激的A431 細胞中MAPK 磷酸化水平。
SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白
1. Phos-tag® Acrylamide的溶解
5 mmmol/ Phos-tag® 液體 (3v/v% 甲醇）：
1)10 毫克 Phos-tag® Acrylamide 里加入 0.1 毫升 甲醇
2)使用槍頭攪拌混合直至*溶解,。
3) 加3.2 毫升 蒸餾水,， 用槍頭混勻。
2-8℃避光保存,。不適合零度以下保存。建議保存時間6個月,。
注意：避免溶解過程出現(xiàn)白色懸浮顆粒,。
2. α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221），陽性對照（含有磷酸化和非磷酸化α-Casein）,，如何使用,？
用水或者上樣buffer溶解。用水溶解后,，冷凍保存,。電泳條件：Phos-tag® 50 umol/L,分離膠濃度 10%。
電流：30 mM,，1小時,。
3. 用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）進行磷酸化蛋白的去磷酸化反應體系。
37℃,，過夜,。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 微升
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 微升
# Sterilized water 39 微升
# Alkaline phosphatase（018-10693）. 0.3 unit / 1 μL有一點需要注意:ALP活性化使用Mg離子,，相同的非磷酸化蛋白質(zhì)用ALP處理的樣品的條帶和沒有用ALP處理的樣品的條帶的位置不同。
4. Phos-tag® SDS-PAGE實驗沒有成功分離磷酸化蛋白：
1）使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽性對照,，確認實驗條件和試劑均沒有問題,。
2）可使用Phos-tag® Biotin檢測樣品中是否有磷酸化蛋白。確認有磷酸化蛋白后,，再通過Phos-tag® SDS-PAGE進行分離鑒定,。
3）經(jīng)質(zhì)譜鑒定有表達磷酸化蛋白，建議增大樣品的含量,，可使用Phos-tag® Agarose進行磷酸化蛋白的富集,。磷酸化蛋白含量過低，會影響其分離效果,。
4）文獻報道有表達磷酸化蛋白,，或者同源蛋白有表達磷酸化蛋白的，建議用Phos-tag® Biotin先確認 樣品中是否有磷酸化蛋白,。
5）建議樣品的pH值在7左右,。酸性或者堿性條件下，二價錳離子 -Phos-tag® 與磷酸化基團的特異性結(jié)合較差,。
6）避免樣品中含有高濃度的還原劑,，變性劑，表面活性劑等,。β-巰基乙醇濃度不高于0.2 M（或者5%）,。
7）進行Phos-tag® SDS-PAGE的合適樣品是純化的蛋白。如果是細胞裂解液,，體外激酶反應液,，組織均漿液等，需要摸索合適的分離膠,，Phos-tag® Acylamide的濃度,。建議Phos-tag® Acrylamide濃度從50 μM開始摸索。
5. Phos-tag® SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗的優(yōu)化建議：
1)可以檢測的樣品包括體外激酶反應體系,，細胞裂解液,，組織均漿液。
2) 每孔樣品的上樣量是10~30 微克（請根據(jù)蛋白表達量進行調(diào)整）
3) 制備樣品中含有的還原劑,、變性劑,、螯合劑、釩酸等會使電泳條帶發(fā)生彎曲或者拖尾,。通過TCA沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量,。
4）建議樣品的pH值在7左右。如果加入上樣緩沖液后溶液顯黃色或者橙色，加入Tris緩沖液調(diào)整pH值為7,。
5）目的蛋白分子量大于60 kDa,，分離膠的丙烯酰胺濃度為6%；目的蛋白分子量小于60 kDa,分離膠的丙烯酰胺濃度為8%,。
6）如果樣品中含有大量蛋白,，比如細胞裂解液，組織均漿液,，Phos-tag®乙酰胺濃度為5~25 uM,。若目的蛋白濃度低，建議Phos-tag® 乙酰胺濃度為100 uM,。
7）Phos-tag® SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗,，濕法轉(zhuǎn)膜建議：10 mM EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10 分鐘，不含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10 分鐘,。重復3次,。強烈建議濕法轉(zhuǎn)膜
8）Phos-tag® SDS PAGE半干法轉(zhuǎn)膜建議：
i.電泳后用含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠，EDTA的濃度為 100 mM,。100 mM EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10 分鐘,，不含有EDTA的轉(zhuǎn)移緩沖液處理凝膠10 分鐘。重復3次,。
ii.轉(zhuǎn)膜的電流值提高2%~3%, 延長時間2成,。
iii.轉(zhuǎn)膜的緩沖液加SDS，加到大約0.05~0.2%,，轉(zhuǎn)膜效率會提高,。
9）使用目的蛋白的非磷酸化抗體即可。比如檢測各種腫瘤細胞系中Src激酶活性實驗,，用Src的非磷酸化抗體即可,。
10)和光的WIDE-VIEW™ Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可檢測作為轉(zhuǎn)膜效率，但是無法判斷分子量,。
11）一般預染的蛋白marker在Phos-tag® SDS-PAGE中條帶會彎曲,，無法判斷蛋白分子量。
12）不能確認磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分離,，請進行常規(guī)的SDS-PAGE，Western Blotting實驗,。比對目的蛋白的遷移率,。
13）不能確認是因為蛋白發(fā)生磷酸化還是出現(xiàn)降解造成蛋白條帶遷移，請進行常規(guī)的SDS-PAGE實驗,，確認不會出現(xiàn)條帶遷移,。
14）目的蛋白磷酸化與非磷酸化分離效果不佳，使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽性對照，確認實驗條件和試劑均沒有問題,。如果確認能夠分離,，調(diào)整分離膠， Phos-tag® Acylamide的濃度,。建議使用品質(zhì)佳的氯化錳（139-00722）,。
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