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細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法的進(jìn)展和未來
閱讀：227 發(fā)布時(shí)間：2024-10-31
包含自革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）在內(nèi)的熱原是可引起發(fā)熱的物質(zhì),，也是醫(yī)藥制品中的有害污染物。當(dāng)醫(yī)藥制品與血液和器官直接接觸時(shí),，其可能包含的熱原會激活人體的先天免疫機(jī)制,，從而可能導(dǎo)致高燒、炎癥,、組織損傷,、敗血癥和休克。[1]因此,，為了滿足監(jiān)管要求,，醫(yī)藥制品需要進(jìn)行熱原檢測，這也是藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量規(guī)格的一部分,。[1]
◆熱原的歷史背景
1875年,，伯頓-桑德森（Burdon-Sanderson）提出了 "熱原"（pyrogen）一詞，用來描述在腐肉的無菌提取物中發(fā)現(xiàn)的一種假設(shè)物質(zhì),，注射后會導(dǎo)致動物發(fā)熱,。1911年，韋赫塞爾曼（Wechselman）發(fā)現(xiàn)在注射灑爾佛散（Salvarsan,，一種治療梅毒的藥物）時(shí),，會因蒸餾水中的細(xì)菌導(dǎo)致患者發(fā)熱，這促使他開始尋找解決方案,。然而,，灑爾佛散不能口服，只能通過注射起效,。因這種注射藥物變得普遍,，熱原控制變得至關(guān)重要 [2] 。
◆熱原檢測
家兔熱原試驗(yàn)（RPT)
Hort和Penfeld于1912年進(jìn)行了家兔熱原試驗(yàn),，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌在家兔身上出現(xiàn)明顯的熱原反應(yīng),，而革蘭氏陽性菌的反應(yīng)則輕微得多[2],。在家兔熱原試驗(yàn)中，通過給家兔注射熱原并記錄體溫升高的發(fā)熱反應(yīng),。但家兔對熱原的反應(yīng)可能與人體的反應(yīng)具有差異，因此檢測存在一定的局限性,。
鱟試驗(yàn)法（LAL）
鱟試驗(yàn)法（LAL,，也稱鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物檢測法）又稱細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法（BET），是一種經(jīng)濟(jì)且獲得廣泛認(rèn)可的替代方法,。鱟試驗(yàn)法通過將鱟血液與細(xì)菌內(nèi)毒素混合,，最終形成一種凝膠或顯色。目前的鱟試驗(yàn)法試劑盒通過利用這種裂解物的濁度特性或顯色特性進(jìn)行檢測,。在熱原檢測方面,，鱟試驗(yàn)法的靈敏度已被證明是家兔法的5倍[3]。
此外,，使用氯化鈣溶液對放射性藥物的鱟試驗(yàn)法進(jìn)行改良,，可避免因螯合劑而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。具體為螯合劑的存在會降低LAL試劑中游離二價(jià)鈣離子的濃度,，從而抑制凝固素凝膠的形成,，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。目前,，美國醫(yī)院和中央放射藥房采用這種改良的LAL檢測法,，用于放射性藥物和試劑盒的質(zhì)量控制檢測[4]。
MAT法（單核細(xì)胞活化試驗(yàn)）
MAT法（單核細(xì)胞活化試驗(yàn)）可用于識別和定量內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?。熱原可激活人體內(nèi)的單核細(xì)胞,，從而釋放介質(zhì)[5]。MAT法通過在體外將人單核細(xì)胞暴露于熱原從而激活單核細(xì)胞,，引發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放,，隨后可使用ELISA技術(shù)對其進(jìn)行定量[6]。MAT法使用人體細(xì)胞,，因此更具生理相關(guān)性,，可以精確地定量識別和檢測內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?/span>[7]。
◆未來展望
從家兔熱原試驗(yàn)到MAT法的轉(zhuǎn)變充滿挑戰(zhàn),，需要付出巨大的努力,。歐洲藥品質(zhì)量管理局、歐洲委員會和歐洲動物試驗(yàn)替代方法合作組織共同舉辦了 "熱原性試驗(yàn)的未來：逐步淘汰家兔熱原試驗(yàn) "的國際會議,，會議重點(diǎn)討論了2026年前從歐洲藥典中刪除家兔熱原試驗(yàn),、高效推動MAT法應(yīng)用的使命，并指出在淘汰家兔熱原檢測方面還存在的差距[8],。
此外,，為符合FDA指南，使用MAT法前必須執(zhí)行特定于產(chǎn)品的驗(yàn)證，以確認(rèn)使用MAT法評估特定檢測物質(zhì)或材料的適用性,。驗(yàn)證過程應(yīng)包含對每個(gè)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)和精確熱原檢測等多種測試,，同時(shí)還需要保證設(shè)備與單核細(xì)胞之間的直接接觸[9]。
參考文獻(xiàn)
1. Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for
rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.
2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation,
2015. 32(2):p. 79-100.
3. Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.
4. Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled
radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.
5. Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic
effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.
6. Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum
albumin. Altex, 2011.28(3): p. 227-35.
7. Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-
Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.
8. Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p.
101702.
9. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.
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