冷凍組織切片的制作

實驗試劑

液氮,，干冰，1％明膠,，4％多聚甲醛,，PBS，含1％NP-40的PBS,，3％BSA／PBS稀釋抗體,，辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB／金屬鹽試劑,，3％過氧化氫,，0.3％(W／V)氯化鎳貯存液，Harris蘇木精,，乙醇

實驗設(shè)備

載玻片,，Whatman 1^＃濾紙，低倍光學(xué)顯微鏡

實驗材料

未受損傷的組織

實驗步驟

1. 將未受損傷的組織切剖成小樣本,，約lcmXIcmX0.4cm,。

2. 將標本放在卡片的一端。標記該卡片,，將帶有標本的一端浸入液氮中,。60s后，取出標本并放在干冰上,。修剪卡片,，使其大小剛好比組織塊稍大些，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的(-70℃)帶有標記的小瓶中,。

3. 切片前,，用1％明膠包被潔凈的載玻片。加熱至50℃使明膠溶于水中,，冷卻,，加入0.02％疊氮鈉。將玻片浸入明膠溶液中30s,，取出,，自然干燥。

4. 按照儀器使用說明書,，用低溫恒溫器制備冷凍切片,。通常切片厚度在5-10gm之間,。用包被過的載玻片收集切片。

5. 讓切片自然干燥,。浸入新鮮配制的4％多聚甲醛中2min,。

6. 用PBS洗數(shù)次，放入含1％NP-40的PBS中5rain,。用PBS洗數(shù)次,。

7. 將帶有組織切片的載玻片放在濕盒中。加合適稀釋度的一抗,，用含蛋白質(zhì)的溶液如3％BSA／PBS稀釋抗體,。

單克隆抗體選用雜交瘤細胞培養(yǎng)上清(特異性抗體濃度為20-50gg／m1)。小鼠腹水,、純化的單克隆抗體和多克隆抗體,，以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)該測試其稀釋度，以使特異性抗體的濃度在0.1～10ug／m1之間,。如果特異性抗體的濃度是未知的,，則制備并測試初始制品的不同稀釋度(1：10，1：100,，1：1000和1：10 000),。

8. 將玻片置濕盒中于室溫下孵育至少60min。對于某些反應(yīng)來說,，孵育時間可延長至24h,，以增加其敏感性。

9. 用PBS洗3次,，每次5min以上,。

10. 加辣根過氧化物酶標記的二抗(特異性針對一抗)。這些試劑可以購自不同的經(jīng)銷商,。如果二抗的確切用量是未知的,，測試1：50—1：1000稀釋的二抗。用含蛋白質(zhì)的PBS稀釋,，如3％BSA／PBS,。

11. 將樣本置濕盒中，于室溫下孵育30min,。

12. 用PBS洗3次,，每次5min以上。

13. 配制DAB／金屬鹽試劑,。將6mg DAB溶于9ml 0.05mol／L Tris緩沖液(pH7.6)中。加lm[0.3％(W／V)氯化鎳貯存液(可用相同濃度的氯化鈷代替),。加0.1ml 3％過氧化氫,。如果出現(xiàn)沉淀，用Whatman 1^＃濾紙(或相似品)過濾。

14. 將上述溶液加到標本中,。在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察,。當形成足夠的棕／黑色沉淀時，用水沖洗以終止反應(yīng),。通常這一反應(yīng)過程約需1-20min,。

15. 加數(shù)滴Harris蘇木精。孵育約5min,。時間長短取決于染色的強度,。

16. 用水輕柔沖洗。

17. 通過各級乙醇使標本依次脫水,。在75％乙醇中孵育兩次,，每次3min，95％乙醇中2次,，每次3min,，100％乙醇中2次，每次3min,。自然干燥,。

18. 加一小滴DPX至標本上。小心在其上面放一蓋玻片(1^＃) 避免產(chǎn)生氣泡,。用紙巾去除多余的液體,。DPX很快可以凝固，樣品便可觀察并照相,。