【免疫熒光】技術全解—染色篇

免疫熒光技術既有抗原抗體反應的高度特異性,，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強,。該方法可用于組織學中抗原或抗體的定位,，也可用于體液標本中抗原或抗體的定量檢測。

一：熒光抗體染色

于已固定的標本上滴加經適當稀釋的熒光抗體,。置濕盒內,，在一定溫度下溫育一定時間,，一般可用
25～37℃ 30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜,。用PBS 充分洗滌干燥,。

熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。經熒光抗體染色的標本應在染色當天鏡檢,，每次鏡下觀察時間以1～ 2h 為宜,，時間過長將使高壓汞燈的發(fā)光亮度下降，熒光減弱,，工作人員觀察過久對眼睛也有不良影響,。作油鏡檢查時，必須用無自發(fā)熒光的鏡油,。

二：影響熒光抗體染色的各種因素

. pH   熒光素在溶劑中基本上處于離子化狀態(tài),，因此，溶劑中的氫離子濃度對熒光強度的影響是極大的,。每一種熒光素都有自己合適的pH值,，它保持熒光素分子與溶劑之間的電離平衡。pH的改變可以引起熒光素熒光光譜的改變,，并可造成熒光強度的降低,。

. 溫度   一般情況下，環(huán)境溫度的升高對熒光染色有明顯的影響,。因為,，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和熒光素分子的動力增大,，使熒光淬滅的可能性隨之加大,，這就使熒光素分子與其他分子之間的相互碰撞幾率增加，因此,，影響了熒光素的熒光強度,。一般情況下，溫度在20℃時,，熒光素即開始表現溫度淬滅作用,。隨溫度升高，熒光淬滅作用就越強,，可至熒光*淬滅,。溫度在20℃以下，熒光素的熒光強度隨溫度的變化改變不明顯,，基本上保持恒量,。因此，在適當的低溫環(huán)境中進行熒光顯微觀察,，可得到更好的效果,。

. 熒光素的濃度   在溶液濃度較稀時,，熒光強度隨熒光素濃度增加而增加。當熒光素濃度增加到一定程度時,，熒光強度達到zui大,。再繼續(xù)增加濃度，熒光素發(fā)生的光可能被鄰近的分子吸收,，使熒光強度下降,。

. 某些細胞固定劑對熒光素有明顯影響   如甲醛固定的細胞比不固定的細胞熒光強度減弱50%左右。雖然醇類固定劑也有輕微的淬滅熒光作用,，但其影響較小,。

. 非特異性熒光染色   免疫熒光染色除特異性熒光之外，還出現一些與靶抗原-抗體反應無關的熒光,，統(tǒng)稱為非特異性熒光,。非特異性熒光染色可由于某些抗原的自發(fā)熒光及交叉反應等多種因素產生。有些非特異性熒光染色可通過對照進行鑒別與排除,，有些則要通過對抗原的純化,、抗體的提純、提高熒光抗體結合物的比例等方面尋找原因逐項清除,。