免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法 一,、標(biāo)本制作 可制作涂片,、印片,、細(xì)胞單層培養(yǎng)物,、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定,，作免疫熒光染色用,。 二、熒光抗體染色方法 （一）直接法 1．染色 切片經(jīng)固定后,，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光 抗體或兔抗人 IgG 或 IgA 熒光抗體等）,，在室溫或37℃染色30min,，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi),，防止 干燥。 2．洗片 傾去存留的熒光抗體,，將切片浸入 pH7.4或 pH7.2PBS 中洗兩次,，攪拌，每次5min,，再用蒸 餾水洗1min,，除去鹽結(jié)晶。 3．用50%緩沖（0.5mol/L 碳酸鹽緩沖液 pH9.0～9.5）甘油封固,、鏡檢 4．對(duì)照染色 ①正常免熒光血清染色,，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性,。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和 未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合,，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性,。為證明此種染色抑制不 是由于熒光抗體被稀釋所致,，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清,，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定,。 ③類屬抗原染色試驗(yàn),，前面已作敘述。 直接法比較簡(jiǎn)單,，適合做細(xì)菌,、螺旋體、原蟲,、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎,、皮膚的檢查和研 究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原,，特異性高而敏感性較低,。 （二）間接法 （1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度,， 37℃作用30min,。然后用0.01mol/l pH7.2PBS 洗兩次，10min,，用吸水吸去或吹干余留的液體,。 （2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟,，染色30min,，37℃，緩沖鹽 水洗兩次10min,，攪拌,，緩沖甘油封固，鏡檢,。 對(duì)照染色：①抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清,，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性,。 ②抗原對(duì)照：即類屬抗原染色,，亦應(yīng)為陰性。③陽性對(duì)照,。 間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）,。另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加 在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合,，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上,，而間接地顯示出組織和細(xì)胞 中抗體的存在，方法步驟如下： ①切片或涂片固定后,，置于染色濕盒內(nèi),。 ②滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃,，30min。 ③緩沖鹽水洗2次,，每次5min,，吹干。 ④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃,，30min,。 ⑤如③水洗。 ⑥緩沖甘油封固,，鏡檢,。 間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高,，操作方法較易掌握,，而且能解決一些 不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血 清的試驗(yàn),。 （三）補(bǔ)體法 1．材料 （1）免疫血清60℃滅活20min,，用 Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4,，1：8……,。補(bǔ)體用1：10 稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等,，按下述的補(bǔ)體法染色,。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32 則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋,。 （2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果,，按2單位的比例， 用 Kolmers 鹽水稀釋備用,。Kolmers 鹽水配法：即在 pH7.4,、0.1mol/L 的磷酸緩沖鹽水中,，溶解 MgSO4的 含量為0.01%濃度,。 （3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下,，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠 球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用 Kolmers 鹽水稀釋備用。 2．方法步驟 （1）涂片或切片固定,。 （2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片 上,，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi),。 （3）用緩沖鹽水洗2次,，攪拌,，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液,。 （4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min,，37℃，水洗同（3）,。 （5）蒸餾水洗1min,，緩沖甘油封固。 3．對(duì)照染色 （1）抗原對(duì)照,。 （2）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清,。 （3）滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min 處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋,，與免疫血清等量混合后,，進(jìn) 行補(bǔ)體法染色。 本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制,，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用,，敏感性亦較 間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用,，節(jié) 省免疫血清,，尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒 等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想,。 （四）膜抗原熒光抗體染色法 本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟,，可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于 T 和 B 細(xì)胞,、細(xì)胞培 養(yǎng)物,、瘤細(xì)胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細(xì)胞膜上,。FACS 即采用此法原理,。 （五）雙重染色法 在同一標(biāo)本上有兩個(gè)抗原需要同時(shí)顯示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗體用 FITC 標(biāo)記,，B 抗原的 抗體用羅達(dá)明標(biāo)記,，可采用以下染色方法： 1．一步法雙染色 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B），按直接法進(jìn)行染色,。 2．二步法雙染色 先用 RB200標(biāo)記的 B 抗體染色,，不必洗去，再用 FITC 標(biāo)記的 A 抗體染色,，按間接法 進(jìn)行,。 結(jié)果：A 抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B 抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。 （六）熒光抗體再染色法 若切片或其他標(biāo)本經(jīng)某種熒光抗體染色后,，未獲得陽性結(jié)果,，而又疑有另外的病原體存在時(shí)，可用相 應(yīng)的熒光抗體再染色,。 有時(shí)存檔蠟塊不能再用以切片,，也可用存檔的 HE 染色標(biāo)本，褪去蓋片和顏色,，再作免疫熒光或其它免疫細(xì) 胞化學(xué)的染色,。 三、熒光抗原染色法 某些抗原可以用熒光素標(biāo)記,，制成熒光抗原,，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗 原可以直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體,，特異性較好,，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法,。 由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴,，一般很少采用此法。