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miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC
Keywords: MT: Non-coding RNAs; Notch; arterialization; endothelial cell; miR-342-5p; shear stress.
血管生成,是指從已有血管發(fā)展形成新的血管,,涉及內(nèi)皮細胞(ECs)的增殖,、分化和遷移,。在生長的血管新生芽融合后,,內(nèi)皮細胞獲得動脈表型并進一步成熟,,最終形成一個穩(wěn)定的分級血管網(wǎng)絡(luò),,通過動脈化的過程灌注組織,。
遺傳程序和環(huán)境因素都參與 EC 動脈化,如血流誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力,、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)信號和 Notch 信號,。以往研究報道了 ECs 中 Notch 下游的 miRNAs,發(fā)現(xiàn)激活Notch 信號至少部分通過 miR-218-5p 下調(diào) MYC 基因表達以抑制細胞周期進程,,靶向異質(zhì)核核糖檢查蛋白A1(HNRNPA1)和眼缺失同源物3(EYA3),。miR-342-5p 是另一種抑制 EC 增殖和血管生成的 Notch 下游 miRNA。研究證明,在 EC 中,,miR-342 可以被層流剪切應(yīng)力上調(diào),。然而,剪切應(yīng)力對 miR-342 的上調(diào)是否由 Notch 信號介導(dǎo),,以及 miR-342 在通過 Notch 信號介導(dǎo)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進 EC 動脈化中的作用尚不清楚,。
鑒于此,空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院韓驊教授/晏賢春副教授及西京醫(yī)院劉曉渭教授團隊合作在Molecular Therapy Nucleic Acids 期刊發(fā)表了題為“miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC"的研究成果,。該研究評估了剪切應(yīng)力,、Notch 信號和 miR-342 之間的關(guān)系及其在促進 EC 動脈化中的下游機制。通過在確定流動條件下培養(yǎng)的 EC,、新生視網(wǎng)膜血管生成和后肢缺血模型,,miR-342 被鑒定為一種機械 miR,通過靶向 EYA3 減弱 MYC 表達來促進 EC 動脈化并改善血流灌注,,從而穩(wěn)定 MYC,。這些結(jié)果提供的見解將有助于優(yōu)化缺血性疾病的血管再生。
首先,,使用體外層流對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)施加15 dyn/cm2剪切應(yīng)力持續(xù)12或24 h以研究miR-342是否對血流誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力(FSS)做出反應(yīng),。與在靜態(tài)對照 HUVECs 相比,FSS 條件下miR-342 及其宿主基因 EVL 顯著上調(diào),。FSS 始終激活 Notch 信號,,并上調(diào) miR-342 和 EVL,這可以被 Notch 抑制劑(DAPT)消除,。這表明,剪切應(yīng)力通過激活 HUVECs 中 Notch 上調(diào) miR-342 表達,?;蚣患治觯?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">GSEA)和熱圖分析顯示,在靜態(tài)培養(yǎng)的 HUVECs 中,,miR-342 過表達上調(diào)了剪切應(yīng)力相關(guān)基因特征,,如 KLF2 和 KLF4。但miR-342 表達降低的 HUVECs 在FSS下無法平行排列,,阻斷miR-342 在LSS下顯著下調(diào) KLF4 和 KLF2 的表達,。這些結(jié)果表明,miR-342 介導(dǎo) ECs 對 FSS 的反應(yīng),。
FSS 激活 Notch 信號,,從而上調(diào)動脈標志物。與此一致的是,,在 FSS 下過表達 miR-342 的 HUVECs 也表現(xiàn)出動脈標志物(包括EFNB2,、GJA4、GJA5和HEY2)表達的顯著增加及靜脈標志物(包括EPHB4、NRP2和NR2F2)表達的減少,,靜態(tài)對照組則呈現(xiàn)相反的效應(yīng),。體內(nèi)熒光原位雜交(FISH)染色顯示,miR-342 陽性信號主要位于腎臟,、肝臟和肺組織的動脈中,。這表明,miR-342 介導(dǎo)剪切應(yīng)力對動脈基因表達增強的影響,。
進一步利用Matrigel栓塞試驗檢測血管生成情況,,免疫染色顯示,miR-342 顯著增加 EC 標志物 CD31 和動脈標志物 GJA4 或血管平滑肌細胞(vSMC)標志物 α-SMA 的共定位,,表明動脈標志物表達和 vSMC 覆蓋率增加(圖1 A,、B)。
在視網(wǎng)膜血管生成模型中,,miR-342 水平也顯著增加,。IB4 與 α-SMA 的免疫染色表明,伴隨著血管密度降低,,miR-342 的上調(diào)顯著增加視網(wǎng)膜血管中的 α-SMA+ vSMC,,表明 vSMC 覆蓋率增加,這是動脈化的標志(圖1 C),。qRT-PCR顯示,,在注射 miR-342 的視網(wǎng)膜中動脈標志物表達增加,而靜脈標志物顯著降低,。相比之下,,玻璃體內(nèi)注射 miR-342 拮抗劑顯著降低了 α-SMA+ vSMC 覆蓋率,而視網(wǎng)膜血管密度略有增加(圖1 D),。這些結(jié)果表明miR-342 在體內(nèi)促進動脈化,。
圖1 miR-342在體內(nèi)增強EC動脈化。
接下來,,評估了 miR-342 與 FSS 在 EC 動脈化調(diào)節(jié)方面的關(guān)系,,發(fā)現(xiàn)阻斷 miR-342 部分消除了 FSS 誘導(dǎo)的動脈標志物上調(diào),這表明,,miR-342 介導(dǎo) FSS 誘導(dǎo)的 ECs 中動脈標志物的上調(diào),。觸發(fā) Notch 激活發(fā)現(xiàn)其在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上上調(diào)動脈標志物并下調(diào)靜脈標志物,但敲低 miR-342 減弱了這些影響,。值得注意的是,,miR-342 的敲低通過 Dll4 觸發(fā)的 Notch 激活減弱動脈化。這些結(jié)果表明,,miR-342 在 FSS 觸發(fā)的 Notch 激活下介導(dǎo) EC 動脈化,。
MYC 基因是一種原癌基因,,它主要參與細胞分裂和增殖過程。Notch 活化通過抑制 MYC 依賴性代謝和細胞周期活動來促進 EC 動脈化,。miR-342 過表達顯著抑制 MYC 調(diào)節(jié)因子和細胞周期進程相關(guān)基因,。一致地,在轉(zhuǎn)染 miR-342 模擬物的 HUVECs 中,,細胞周期進程減慢,。這表明,miR-342 可能通過抑制 MYC 表達來減弱 EC 細胞周期進程,。
進一步驗證 MYC 在 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化中的作用,,發(fā)現(xiàn) MYC 表達在 FSS 和 Notch 激活下降低。同樣,,miR-342 過表達顯著下調(diào) HUVECs 中 MYC 的 mRNA 和蛋白水平(圖2 A,、B),相比之下,,miR-342 敲低上調(diào)了兩者水平(圖2 A,、C),而阻斷miR-342 消除了 Notch 激活對 MYC 表達的抑制,。這些結(jié)果表明,,miR-342 通過被 FSS 觸發(fā)的 Notch 活化介導(dǎo)對 MYC 的抑制。
此外,,MYC 過表達顯著促進了細胞周期進程(圖2 D,、E),且消除了 miR-342 過表達誘導(dǎo)的 EC 動脈化,,多種動脈標志物的 mRNA 和蛋白表達被抑制,,而靜脈標志物的表達得到恢復(fù)(圖2 F、G),。這些結(jié)果證實 miR-342 通過抑制 MYC 增強動脈化,。
圖2 MYC 過表達消除了 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化。
生物信息學(xué)分析表明MYC不是miR-342的直接靶點,,然而,通過蛋白磷酸酶2A(PP2A)去磷酸化Thr58和Ser62來增加MYC蛋白穩(wěn)定性的EYA3的3'-UTR含有miR-342識別位點,。進一步研究表明,,EYA3 過表達消除了 miR-342 過表達誘導(dǎo)的 MYC 的 Thr58 磷酸化和 Ser62 去磷酸化,并增加了 HUVECs 中 MYC 蛋白水平,。此外,,EYA3 過表達消除了 miR-342 誘導(dǎo)的 EC 動脈化。這些結(jié)果表明,,miR-342 通過直接靶向 EYA3 下調(diào) MYC 來促進 EC 動脈化,。
EC 動脈化是缺血性損傷后血管灌注的重要步驟,。最后,為了評估 miR-342 是否可用于改善組織缺血后的血管灌注,,實驗通過結(jié)扎小鼠建立了后肢缺血模型,。結(jié)果顯示,miR-342 與其宿主基因Evl在結(jié)扎的股動脈中的表達顯著降低,。FISH 染色進一步表明,,結(jié)扎側(cè) ECs 中 miR-342 的表達顯著降低(圖3 A)。然后,,在多側(cè)肌肉注射 miR-342 激動劑,,結(jié)果顯示,其在損傷后第 7 天和第 14 天顯著改善了血管灌注(圖3 B),。此外,,在 CD31+ ECs 中,與未結(jié)扎組相比,,結(jié)扎后 GJA4 表達以及 CD31+ ECs 和 α-SMA+ vSMCs 的共定位顯著下調(diào),,而 miR-342 注射顯著改善了下調(diào)的動脈化(圖3 C、D),。這些結(jié)果表明,,局部 miR-342 注射可能通過增強缺血性疾病中的 EC 動脈化來促進血管灌注。
圖3 在后肢缺血模型中miR-342 促進 EC 動脈化并增加血流灌注,。
圖4 圖形概要
miR-342-5p通過靶向EYA3抑制MYC,,介導(dǎo)剪切應(yīng)力和Notch激活對促進EC動脈化的影響,這在缺血性疾病的治療中具有潛力,。
總之,,該研究結(jié)果揭示了剪切應(yīng)力和 Notch 信號介導(dǎo)的內(nèi)皮動脈化的潛在機制,即 miR-342 充當介導(dǎo)剪切應(yīng)力-Notch 信號軸的機械 miR,,通過直接靶向 EYA3 下調(diào) MYC 來促進內(nèi)皮動脈化,。因此,miR-342 可能是治療缺血性疾病的潛在靶點,。
參考文獻:Zhang X, Sun J, Zhang P, Wen T, Wang R, Liang L, Yang Z, Li J, Zhang J, Che B, Feng X, Liu X, Han H, Yan X. miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Apr 4;32:343-358. doi: 10.1016/j.omtn.2023.03.022. PMID: 37128275; PMCID: PMC10148082
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