SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis

KWS：SIRT1,；bone repair；type H vessel formation,；osteogenesis

骨缺損可由感染、腫瘤切除或外傷引起,，潛在的嚴(yán)重后果包括骨折和畸形,。目前，自體骨移植,、牽引成骨和膜誘導(dǎo)再生技術(shù)是治療骨缺損常用的方法,。然而，這些方法可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)令人滿意的愈合,，部分原因是血管再生不足,。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，H型血管是一種高表達(dá)血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（CD31）和內(nèi)皮粘蛋白（EMCN）的特異性毛細(xì)血管亞型。通過(guò)介導(dǎo)血管生成-成骨耦聯(lián)機(jī)制,，這種毛細(xì)血管亞型可維持骨穩(wěn)態(tài),。此外，H 型血管的缺失也會(huì)抑制再生組織中的成骨,，其受 H 型血管中骨祖細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié),。成骨和血管生成耦聯(lián)涉及多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路，包括血小板源性生長(zhǎng)因子BB,、低氧誘導(dǎo)因子-1α,、Notch信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等,。然而,，目前尚不清楚調(diào)節(jié)因子是否增強(qiáng)了 H 型血管和成骨之間的耦聯(lián)功能以進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)。

Sirtuin 1（SIRT1）是一種 NAD（+）依賴性脫乙酰酶,，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能并維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài),。此外，SIRT1 控制血管生成過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的血管生成活性,。以往研究報(bào)道,，SIRT1 激活劑的持續(xù)釋放通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞分化來(lái)恢復(fù)不平衡的骨穩(wěn)態(tài)。然而,，SIRT1 是否調(diào)節(jié)骨缺損中的 H 型血管仍有待闡明,。

最近，華西-國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心的課題組進(jìn)行了深入探索,，假設(shè) SIRT1 在 H 型血管生成中起調(diào)節(jié)作用,，影響骨缺損的愈合。為了檢驗(yàn)這一假設(shè),，研究人員構(gòu)建了 HUVECs 和成骨細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng),，探討了 SIRT1 的激活或抑制對(duì) HUVEC 血管生成和成骨特性的影響；還評(píng)估了 SIRT1 活性對(duì)小鼠股骨和下頜骨缺損中 H 型血管和成骨作用的影響,。研究結(jié)果確定了通過(guò) H 型血管增強(qiáng)骨修復(fù)的創(chuàng)新且可行的靶點(diǎn),。該研究發(fā)表于Cell Proliferation 期刊題為“SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis"。

首先,，CCK8 測(cè)定顯示,，SRT1720（SIRT1激活劑）處理促進(jìn)了 HUVEC 增殖，而EX527（SIRT1抑制劑）處理則具有相反的效果,。劃痕傷口愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,，SIRT1 激活增加了 HUVEC 遷移，而 SIRT1 抑制則具有相反的效果,。定量分析結(jié)果表明,，SRT1720 處理時(shí)細(xì)胞遷移顯著增加，EX527 處理后細(xì)胞遷移減少,。此外,，SIRT1 活化的 HUVECs 在基質(zhì)膠上形成了更多的管狀結(jié)構(gòu)和分支，而抑制 SIRT1 會(huì)削弱這種能力,。還觀察到 SIRT1 活性水平與 CD31,、EMCN 和 VEGF 表達(dá)之間存在正相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明,，激活SIRT1 增強(qiáng)了 HUVECs 的增殖,、遷移和血管生成。

隨后,，根據(jù)初步結(jié)果,，研究人員利用 SRT1720 和 EX527 來(lái)檢查 SIRT1 激活或抑制對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞血管生成和成骨能力的影響（圖1 A）。

關(guān)于血管生成,，觀察到直接共培養(yǎng)導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)形成,，即使在沒(méi)有基質(zhì)膠的情況下也是如此。免疫熒光染色顯示,，CD31 高表達(dá),，表明該網(wǎng)絡(luò)主要由 HUVECs 形成。SIRT1 激活顯著增強(qiáng)了共培養(yǎng)系統(tǒng)中血管網(wǎng)絡(luò)的形成,，而 SIRT1 抑制則減少了血管生成（圖1 B,、C）。此外,，血管生成基因和蛋白（VEGF,、CD31、EMCN 和 HIF1A）的表達(dá)在 SIRT1 激活后增加（圖1 D,、E）,，且觀察到血管生成因子 SLIT3 的分泌量也顯著增加（圖1 F）。

ALP 和 ARS 染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,，SIRT1 激活顯著增強(qiáng)了共培養(yǎng)系統(tǒng)的成骨能力（圖1 G）,。此外，成骨因子（ALP,、RUNX2,、OSX 和 COL1A）的表達(dá)水平增加，而抑制 SIRT1 削弱了系統(tǒng)的成骨能力（圖1 H,、I）,。此外，培養(yǎng)基中 HUVECs 衍生的 TGF-β 濃度顯著增加,，SIRT1 激活進(jìn)一步放大了這種效應(yīng)（圖1 J）,。然而，激活或抑制SIRT1 均未觀察到成骨細(xì)胞成骨能力的顯著增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)表明,，激活SIRT1 在體外促進(jìn) HUVEC/成骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成和成骨能力,。

圖1   SIRT1激活增強(qiáng)了HUVEC/成骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成和成骨能力。  

免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示,，共培養(yǎng)增加了與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）通路相關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化水平,，而在激活或抑制 SIRT1 后，磷酸化水平分別進(jìn)一步增強(qiáng)或減弱,。siRNA 轉(zhuǎn)染后,，AKT 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)顯著降低，且血管生成相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)也明顯減少,。共培養(yǎng)系統(tǒng)中的血管網(wǎng)絡(luò)數(shù)量也減少了,。此外，ALP 染色顯示,，在 si-AKT 轉(zhuǎn)染后,，共培養(yǎng)系統(tǒng)的成骨能力降低，與成骨相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著降低,。這說(shuō)明,，PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路介導(dǎo) SIRT1 在 HUVEC/成骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中的作用。

為了提供進(jìn)一步的證據(jù)支持 SIRT1 在骨愈合中的作用,，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠股骨或下頜骨的骨缺損,，然后用 SRT1720 或 EX527 處理（圖2 A）。值得注意的是,，激活的SIRT1 在不同時(shí)間點(diǎn)顯著促進(jìn)骨缺損愈合,，而抑制 SIRT1 會(huì)減緩股骨和下頜骨的這一過(guò)程（圖2 B-E）。對(duì)于股骨,，定量分析顯示,，SRT1720處理組在 14 天時(shí)僅在骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）的骨愈合參數(shù)值上存在顯著差異，其他測(cè)量值之間無(wú)顯著差異（圖2 C）,。此外,，下頜骨中骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、Tb.Sp 和骨小梁厚度（Tb.Th）在 SRT1720處理后 14 天也存在顯著差異,，而其他指標(biāo)未觀察到差異（圖2 E）,。與這些發(fā)現(xiàn)一致，HE 和 Masson 的骨缺損三色染色也表明,，SRT1720處理促進(jìn)了新骨的形成和成熟（圖2 F,、G）。這些數(shù)據(jù)表明,，SIRT1 的激活促進(jìn)股骨和下頜骨缺損后的骨愈合,。

圖2    SIRT1激活促進(jìn)股骨和下頜骨缺損的骨愈合,。

免疫熒光染色顯示，SRT1720 處理顯著促進(jìn)了股骨缺損中 H 型血管系統(tǒng)的生成,，而 EX527 則阻礙了這一過(guò)程,。在第 7 天和第 14 天之間，定量分析顯示,，H 型血管標(biāo)志物的表達(dá)存在顯著差異,。對(duì)于與骨缺損附近的 H 型血管共表達(dá)的成骨因子,，如 ALP 和 RUNX2,，SIRT1 激活顯著增加了它們的表達(dá)，而 SIRT1 抑制則具有相反的效果,。

在下頜骨缺損中,，SIRT1 活化也與 H 型血管呈正相關(guān)。此外,，SRT1720處理組下頜骨缺損中 ALP 和 RUNX2 的表達(dá)顯著升高,。然而，在 EX527 處理組中,，觀察到 RUNX2 表達(dá)存在顯著差異,，而非ALP 表達(dá)。

缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF1A）表達(dá)與 H 型血管的形成密切相關(guān),。SIRT1 的激活上調(diào)了骨缺損部位的 HIF1A 表達(dá)（圖3 A,、B）。在股骨缺損中,，HIF1A 表達(dá)與 SIRT1 活性之間存在良性關(guān)聯(lián)（圖3 C）,。在下頜骨缺損中，HIF1A 表達(dá)在初期較高,，后期降低,，這與在 H 型血管形成中觀察到的變化一致（圖3 D）。此外,，SIRT1 激活顯著增加了骨缺損中 p-AKT 和 p-FOXO1 的表達(dá)（圖3 E-H）,。以上數(shù)據(jù)表明，SIRT1 的激活通過(guò) PI3K/AKT/FOXO1 通路增強(qiáng)骨缺損中 H 型血管和成骨/血管生成因子的耦聯(lián),。

圖3    SIRT1的激活通過(guò)AKT-相關(guān)通路促進(jìn)HIF1A在股骨和下頜骨缺損中的表達(dá),。

圖4    SIRT1 的激活增強(qiáng)了 H 型血管生成與成骨的耦聯(lián)，通過(guò) PI3K/AKT/FOXO1 信號(hào)通路促進(jìn)骨修復(fù),。抑制 SIRT1 會(huì)削弱血管和骨形成,，突出了 SIRT1 在耦聯(lián)過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

總之,，這項(xiàng)研究利用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)和骨缺損模型為 SIRT1 在 H 型血管發(fā)育和骨修復(fù)中的功能提供了重要見(jiàn)解,。它還為 SIRT1 激活劑在促進(jìn)骨愈合中的臨床應(yīng)用提供了更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù),。然而，為了充分闡明這些過(guò)程的潛在機(jī)制并研究 SIRT1 在臨床環(huán)境中的治療潛力,，未來(lái)有必要進(jìn)行更深入的研究,。

參考文獻(xiàn)：Liu Z, Liu H, Liu S, Li B, Liu Y, Luo E. SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis. Cell Prolif. 2024 Jun;57(6):e13596. doi: 10.1111/cpr.13596. Epub 2024 Jan 11. PMID: 38211965; PMCID: PMC11150139.

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