顳下頜關(guān)節(jié)（TMJ）是骨關(guān)節(jié)炎（OA）最常見的部位之一,。與其他關(guān)節(jié)的OA類似,，軟骨鈣化是顳下頜關(guān)節(jié)OA的變化之一,。鈣晶體,，如堿性磷酸鈣（BCP）和焦磷酸鈣二水合物（CPPD）晶體,，形成鈣化結(jié)節(jié),，進(jìn)一步刺激軟骨炎癥和基質(zhì)降解，加重OA軟骨的退化,。然而,，OA軟骨中異常鈣化形成的機(jī)制仍有待確定。

外泌體是由活細(xì)胞分泌的直徑為30-100nm的囊泡樣小體,。研究表明,，外泌體可促進(jìn)動脈粥樣硬化和慢性腎臟病等疾病的異常鈣化。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中wei'yi的細(xì)胞類型,，在維持軟骨穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要,。然而，關(guān)于軟骨細(xì)胞來源的外泌體在OA中的作用的研究很少,。此外,，顳下頜關(guān)節(jié)OA期間退變軟骨出現(xiàn)明顯的異常鈣化，軟骨細(xì)胞周圍異常鈣化基質(zhì)中有大量外泌體樣雙層囊泡結(jié)構(gòu),，提示退變軟骨細(xì)胞來源的外泌體可能參與顳下頜骨OA軟骨異常鈣化,。

在第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院等研究團(tuán)隊的一項研究中,，建立了大鼠單側(cè)前牙反牙合（UAC）,，從而誘導(dǎo)出TMJ OA的病損，包括軟骨厚度減少,、基質(zhì)成分合成減少,、基質(zhì)降解分子表達(dá)增加、軟骨細(xì)胞異常分化等典型OA軟骨退變表現(xiàn),；然后采用流體流動剪切應(yīng)力（FFSS）刺激的顳下頜關(guān)節(jié)OA大鼠和原代髁突軟骨細(xì)胞為研究對象,，在異常生物力學(xué)刺激下，探討軟骨細(xì)胞來源的外泌體是否參與OA軟骨異常鈣化的調(diào)控。

TMJ OA大鼠退變軟骨存在異常鈣化

在UAC刺激大鼠的TMJ髁突軟骨出現(xiàn)無細(xì)胞區(qū),，軟骨細(xì)胞排列紊亂,。同時，軟骨基質(zhì)降解加劇,。此外，UAC組髁突軟骨鈣化層厚度及鈣化層占整個軟骨厚度的比例均顯著高于對照組,。隨著組織形態(tài)學(xué)的變化,，UAC組大鼠髁突軟骨中II型膠原和聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)顯著降低，而軟骨細(xì)胞去分化標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶-13,、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2和骨鈣素顯著增加,。這表明，TMJ OA大鼠退變軟骨存在異常鈣化

TMJ OA大鼠退變軟骨中外泌體增加

IHC染色顯示,，CD63是外泌體的標(biāo)志物,，主要位于對照組大鼠 TMJ 髁突軟骨內(nèi)的肥大層深層。然而,，在UAC組中,，在TMJ 髁突軟骨的前肥大層中也發(fā)現(xiàn)了CD63陽性軟骨細(xì)胞。在3個時間點上（2,、4,、8周），UAC組CD63陽性軟骨細(xì)胞比值均高于對照組,，CD63的mRNA表達(dá)在UAC 組中也顯著高于對照組（圖 1 A）,。TEM圖像顯示，與同期對照組相比,，在4周和8周時UAC實驗組大鼠TMJ髁突軟骨肥大層細(xì)胞周圍基質(zhì)中存在線性鈣化殘留痕跡（圖1 B）,。此外，在軟骨細(xì)胞和鈣化殘留痕跡之間,，存在大量直徑50-100 nm左右類似外泌體的雙層膜包裹囊（圖1 B）,。

MGP是一種鈣化抑制分子，而TNAP和NPP1是促進(jìn)鈣化的酶,。UAC組大鼠髁突軟骨中MGP陽性軟骨細(xì)胞和Mgp的mRNA表達(dá)顯著降低,。TNAP-陽性和NPP1-陽性軟骨細(xì)胞的比例以及Tnap和Npp1的mRNA表達(dá)在UAC組大鼠髁突軟骨中顯著增加。

圖1   UAC大鼠TMJ OA 軟骨中外泌體的形成增加,。

（A）UAC大鼠髁突軟骨中CD63陽性軟骨細(xì)胞數(shù)量和CD63的mRNA表達(dá)增加,。（B）TEM觀察年齡匹配對照組和UAC組大鼠的髁突軟骨。1-6中的白色箭頭指出了軟骨細(xì)胞周圍的鈣化邊緣,。1-3顯示對照組鈣化,，4-6顯示UAC組鈣化，7-9顯示鈣化基質(zhì)中外泌體樣結(jié)構(gòu)增加。

FFSS促進(jìn)原代髁突軟骨細(xì)胞外泌體形成和鈣化

為了在體外模擬TMJ OA的異常生物力學(xué)環(huán)境,，用FFSS（4,、8和16 dyn/cm2，1小時）刺激大鼠TMJ髁突原代軟骨細(xì)胞,。茜素紅染色顯示,，隨著FFSS幅度的升高，髁突原代軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加（圖2 A）,，伴有 CD63 表達(dá)的升高（圖2 B）,，提示TMJ髁突軟骨細(xì)胞在FFSS刺激后分泌外泌體增多。此外,，髁突軟骨細(xì)胞分泌的外泌體MGP隨著FFSS值的升高顯著降低,，而TNAP和NPP1顯著增加（圖2 C）。

圖2   FFSS促進(jìn)培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞的鈣化和外泌體形成,，并改變外泌體中的蛋白質(zhì)水平,。

（A）FFSS促進(jìn)培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的形成。（B）FFSS促進(jìn)培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞的外泌體形成,。（C） FFSS改變了外泌體中的蛋白質(zhì)水平,，如MGP表達(dá)降低以及TNAP和NPP1表達(dá)增加。

抑制外泌體形成減輕FFSS誘導(dǎo)的原代軟骨細(xì)胞鈣化

根據(jù)以上結(jié)果,，選擇16 dyn/cm2 的FFSS刺激原代髁突軟骨細(xì)胞,。不同濃度的GW4869用于抑制外泌體的形成。茜素紅染色顯示,，GW4869顯著且呈劑量依賴性地減少了FFSS刺激后原代髁突軟骨細(xì)胞中形成的鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量（圖3 A）,。CD63的蛋白質(zhì)水平也因GW4869而顯著降低（圖3 B）。然而,，分泌的外泌體中MGP,，TNAP和NPP1的蛋白質(zhì)水平不受GW4869的影響（圖3 C），表明GW4869對鈣化的抑制作用主要是通過抑制外泌體形成而不是通過外泌體內(nèi)含物的變化來實現(xiàn)的,。

為了確定外泌體中的成分是否參與鈣化,，選擇16 dyn/cm2 的FFSS作為刺激條件，分別給予髁突軟骨細(xì)胞1 μg/ml MGP,、10 μM SBI-425（TNAP抑制劑）和10 μM Ennp-1-IN-1（NPP1抑制劑）,。茜素紅染色顯示，加入MGP,、SBI-425和Ennp-1-IN-1后,，培養(yǎng)的TMJ 軟骨細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少（圖3 D），表明對外泌體蛋白質(zhì)成分的相應(yīng)作用也可以顯著抑制 TMJ 軟骨細(xì)胞的鈣化,。

實驗還將16 dyn/cm2的FFSS刺激下髁突軟骨細(xì)胞分泌的外泌體加入到不同濃度的無FFSS刺激培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中,。茜素紅染色顯示，鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量以劑量依賴性方式顯著增加（圖3 E），表明由FFSS刺激的髁突軟骨細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)鈣化,。

圖3   抑制外泌體形成可緩解FFSS誘導(dǎo)的髁突軟骨細(xì)胞鈣化,。

（A）用GW4869抑制外泌體形成減少了培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞中FFSS刺激后鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。（B）GW4869減少用FFSS刺激的髁突軟骨細(xì)胞外泌體形成,。（C）抑制外泌體形成不影響FFSS誘導(dǎo)的外泌體中蛋白質(zhì)水平的變化,。（D）補(bǔ)充外源性MGP或抑制TNAP和NPP1可有效減少FFSS刺激的髁突軟骨細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。（E）用FFSS刺激髁突軟骨細(xì)胞的外泌體促進(jìn)培養(yǎng)的髁突軟骨中鈣化結(jié)節(jié)的形成,。

局部注射GW4869可抑制 TMJ OA大鼠軟骨的鈣化

為了明確抑制外泌體形成對 TMJ  OA軟骨鈣化的治療效果,，實驗將外泌體局部注射到UAC大鼠的TMJs 中。與UAC組大鼠相比,，注射GW4869的UAC大鼠髁突軟骨中的番紅O陽性區(qū)域顯著增加，表明軟骨基質(zhì)中的蛋白聚糖增加,。此外,，在8周和12周時，GW4869注射組軟骨的組織形態(tài)分級明顯較低（圖4 A）,。GW4869注射組 TMJ 髁突軟骨鈣化層厚度及占整個軟骨的比例均顯著低于UAC注射組（圖4 B）,。注射GW4869后，Col2a1,、聚集蛋白聚糖,、Mmp13、Runx2和骨鈣素的mRNA表達(dá)均下降,。

為了驗證外泌體在促進(jìn)體內(nèi) TMJ 軟骨鈣化中的作用,，用16 dyn/cm2 的FFSS刺激髁突軟骨細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中的外泌體,，然后局部注射到對照大鼠的TMJ中,。注射外泌體后，髁突軟骨中的番紅O陽性區(qū)域明顯減少,，表明軟骨基質(zhì)中的蛋白聚糖減少,。此外，在8周和12周時,，外泌體注射組軟骨的組織形態(tài)分級也顯著增加（圖4 C）,。外泌體注射組髁突軟骨鈣化層厚度及占整個軟骨的比例均高于對照組（圖4 D）。外泌體注射組中Col2a1,、聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)顯著降低,，而Mmp13，Runx2和骨鈣素的mRNA表達(dá)增加,。

實驗還在12周時檢測了對照組,、外泌體注射組、UAC 組和外泌體抑制劑注射 UAC 組中大鼠 TMJ 髁突軟骨中促炎細(xì)胞因子（包括 TNF-α、IL-1β,、IL-6 和 IL-18）的表達(dá),。結(jié)果顯示，與對照組相比,，外泌體注射組和UAC組促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)顯著增加,。 同時，與UAC組相比,，外泌體抑制劑注射 UAC 組中促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)顯著降低,。

圖4   局部注射GW4869和外泌體對大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨退變和髁突軟骨鈣化的影響。

（A）在注射GW4869的UAC大鼠中,，顳下頜關(guān)節(jié)的軟骨退變得到緩解,。（B）軟骨鈣化在注射GW4869的UAC大鼠中得到緩解。（C）在對照大鼠中用外泌體注射誘導(dǎo)TMJ軟骨退變,。（D）在對照大鼠中用外泌體注射誘導(dǎo)TMJ的軟骨鈣化,。

異常的生物力學(xué)負(fù)荷會降低顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞中的鈣化抑制劑（如MGP）表達(dá)，并增加啟動子（如NPP1和TNAP）的表達(dá),，從而改變軟骨細(xì)胞來源的外泌體中相關(guān)分子的水平,。此外，異常的生物力學(xué)負(fù)荷促進(jìn)外泌體的形成和分泌,。分泌的外泌體促進(jìn)軟骨基質(zhì)的鈣化,。抑制外泌體形成可有效緩解 TMJ OA退變軟骨的異常鈣化。該研究為外泌體對骨關(guān)節(jié)炎軟骨的影響提供了新的見解,，揭示了外泌體不僅在OA過程中誘導(dǎo)炎癥變化,，還會導(dǎo)致軟骨異常鈣化，從而使軟骨的力學(xué)性能變差,，進(jìn)而加劇OA中軟骨的破壞,。

參考文獻(xiàn)：Liu Q, Wang R, Hou S, He F, Ma Y, Ye T, Yu S, Chen H, Wang H, Zhang M. Chondrocyte-derived exosomes promote cartilage calcification in temporomandibular joint osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2022 Feb 14;24(1):44. doi: 10.1186/s13075-022-02738-5. PMID: 35164837; PMCID: PMC8842872.