骨缺損指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞,，是臨床常見(jiàn)病,?；诟杉?xì)胞的骨組織工程技術(shù)是再生骨缺損的一種有前途的策略。骨組織工程的基本概念是通過(guò)結(jié)合生長(zhǎng)因子,、合適的支架和特定的成骨細(xì)胞或其祖細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生新的骨,。然而，骨組織是由幾種細(xì)胞類型及其周圍的細(xì)胞外基質(zhì)形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu),。因此,，了解每種細(xì)胞類型之間的關(guān)系以達(dá)到成功的骨再生非常重要。由于這些原因,，研究人員已轉(zhuǎn)向共培養(yǎng)研究以增強(qiáng)骨骼再生,。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是組織工程中細(xì)胞治療的重要來(lái)源。間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸誘導(dǎo)直接效應(yīng),，并分泌趨化因子和細(xì)胞因子用于旁分泌和自分泌功能,，在組織再生中產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)支持。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力,，并且EPCs在血管生成中的作用已在體外和體內(nèi)得到廣泛研究,。EPCs能夠促進(jìn)宿主骨缺損的再生，這可能是血管形成增加和參與骨愈合的其他細(xì)胞/分子因素的結(jié)果,。EPCs與MSCs的結(jié)合對(duì)細(xì)胞增殖和分化有深遠(yuǎn)的影響,。研究表明，EPCs和MSCs的共同培養(yǎng)可顯著改善骨形成,，但MSCs和EPCs在成骨中的關(guān)系尚未闡明,。

因此，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科,、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用MSCs和EPCs研究它們的成骨相互作用,，鑒定驅(qū)動(dòng)這種相互作用的基因表達(dá)變化，確定EPCs如何影響MSCs的成骨分化,，并研究了絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路在成骨分化中的參與,。

首先，內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)分離鑒定后，設(shè)立兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照組,。然后鑒定了成骨誘導(dǎo)過(guò)程中EPCs-MSCs 共培養(yǎng)與MSCs單培養(yǎng)組的差異調(diào)控基因,。差異表達(dá)基因的KEGG富集分析表明，許多信號(hào)通路,，包括MAPK,，ECM-受體相互作用，TNF,，PI3K-Akt和HIF-1，都受到共培養(yǎng)的EPCs的調(diào)控,。在這些通路中,，MAPK主要受到與EPCs共培養(yǎng)的影響。

接下來(lái),，為了研究EPCs對(duì)MSCs分化的影響,，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)MSCs。結(jié)果表明,，當(dāng)與EPCs共培養(yǎng)時(shí),，MSCs在分化方面表現(xiàn)不同。當(dāng)MSCs 與EPCs共培養(yǎng)時(shí),，觀察到ALP（堿性磷酸酶）增加,。實(shí)驗(yàn)在第1天、第7天和第14天測(cè)量ALP活性,，數(shù)據(jù)顯示,，當(dāng)MSCs與EPCs共培養(yǎng)時(shí)，ALP活性增加,，與第1天和第7天相比,，第14天時(shí)ALP活性最高，EPCs在7 和14 天顯著提高了MSCs的ALP活性,，分別提高了14.91% 和30.52%（圖1 a）,。

在第14天進(jìn)行qRT-PCR定量成骨基因表達(dá)，包括Runx2,、OPN和BSP,，以研究EPCs對(duì)MSCs分化的影響。結(jié)果表明,，與單層間充質(zhì)干細(xì)胞相比,，EPCs在共培養(yǎng)的MSCs中顯著提高了42.16% 的OPN mRNA表達(dá)，BSP和Runx2 mRNA水平在共培養(yǎng)的MSCs中也分別顯著提高了29.87% 和34.52%（圖1 b）,。

這些數(shù)據(jù)表明,，EPCs增加間接共培養(yǎng)的MSCs的成骨基因表達(dá)。

圖1   EPCs促進(jìn)MSCs的成骨分化。

（a）在誘導(dǎo)成骨分化后第7,、14和21天通過(guò)ALP染色確定成骨分化,。（b）在成骨分化誘導(dǎo)后第14天通過(guò)qRT-PCR測(cè)量成骨基因OPN，BSP和Runx2的表達(dá),。（c）EPCs促進(jìn)MSCs的MAPK信號(hào)通路的激活,，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢查p38、p-p38,、ERK1/2,、p-ERK1/2、JNK和p-JNK表達(dá),。（d）通過(guò)免疫印跡法測(cè)定p38,、p-p38、ERK1/2,、p-ERK1/2,、JNK和p-JNK的蛋白質(zhì)水平，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照,。

此外,，qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法用于評(píng)估MAPK通路是否參與成骨。與單獨(dú)培養(yǎng)的MSCs相比,，與 EPCs共培養(yǎng)的MSCs中的p38磷酸化水平顯著上調(diào),。然而，JNK和ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有顯著改變（圖1 c,、d）,。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，在MSCs-EPCs共培養(yǎng)組中,，p38基因表達(dá)顯著上調(diào)75.27%,。在MSCs-EPCs共培養(yǎng)組中，TAB1和MKK6基因表達(dá)也顯著上調(diào)116.93% 和112.51%（圖1 e）,。這些數(shù)據(jù)表明,，EPCs 促進(jìn) TAB1、MKK6 和 p38 基因表達(dá)以及 p38 磷酸化,。

為了進(jìn)一步研究EPCs是否通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)MSCs的成骨分化,，實(shí)驗(yàn)使用了p38信號(hào)抑制劑SB 203580，ERK信號(hào)抑制劑FR180204和 JNK 抑制劑 SP600125 來(lái)評(píng)估共培養(yǎng)的 MSCs 中 MAPK 信號(hào)通路和成骨分化的變化,。用特異性通路抑制劑處理后,，測(cè)定p38、ERK1/2,、JNK的蛋白質(zhì)及其磷酸化蛋白水平和MSCs的成骨能力,。結(jié)果表明,，通過(guò)SB203580、FR180204和 SP600125處理,，p38,、ERK1/2和JNK磷酸化水平顯著降低（圖2 a、b）,。ALP實(shí)驗(yàn)和茜素紅染色進(jìn)一步證實(shí)了MAPK信號(hào)通路對(duì)MSCs成骨分化能力的調(diào)控,。結(jié)果表明，SB203580顯著降低了ALP水平和鈣結(jié)節(jié)形成（圖2 c-f）,。這些數(shù)據(jù)表明,，EPCs通過(guò)促進(jìn)p38 MAPK信號(hào)通路激活來(lái)參與MSCs 的成骨分化。

圖2   EPCs通過(guò)促進(jìn)MAPK磷酸化誘導(dǎo)成骨分化,。

（a）MSCs 用p38通路抑制劑SB203580,、ERK通路抑制劑FR 180204或JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理，然后與EPCs共培養(yǎng),，并通過(guò)免疫印跡檢查p38、p-p38,、p-ERK1/2,、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白質(zhì)水平,。（b）通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)p-p38,、p38、p-ERK1/2,、ERK1/2,、p-JNK和JNK的相對(duì)蛋白水平，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照,。（c）通過(guò)ALP染色確定成骨分化,。（d）鈣結(jié)節(jié)的形成通過(guò)茜素紅染色測(cè)定。（e）相對(duì)ALP活性,。（f）相對(duì)礦化水平,。

實(shí)驗(yàn)證明了p38信號(hào)通路在共培養(yǎng)的MSCs中起著重要作用。在此觀察之后,，實(shí)驗(yàn)最后使用p38 siRNA沉默進(jìn)一步探索了p38MAPK在促進(jìn)MSCs成骨分化中的功能,。p38 siRNA用于阻止p38MAPK通路激活。結(jié)果觀察到p38 siRNA添加到細(xì)胞后,，p38磷酸化水平顯著降低,。然而，p-JNK和p-ERK1/2表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變（圖3 a,、b）,。接下來(lái),，研究了p38 siRNA對(duì)MSCs成骨分化的影響。數(shù)據(jù)顯示,，p38沉默顯著降低了Runx2,、OPN、BSP和Col I蛋白表達(dá)水平（圖3 c,、d）,。一致地，ALP水平和鈣結(jié)節(jié)形成均受到p38沉默的抑制（圖3 e-h）,。因此,，EPCs通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)MSCs的成骨分化具有積極影響。

圖3   p38 MAPK信號(hào)通路參與MSCs成骨分化,。

（a）用siRNA-p38轉(zhuǎn)染MSCs,，并通過(guò)免疫印跡檢查p-p38、p38,、p-ERK1/2,、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白表達(dá),，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照,。（b）p-p38、p38,、p-ERK1/2,、ERK1/2、p-JNK 和 JNK 相對(duì)蛋白質(zhì)水平的密度測(cè)定法,。（c）免疫印跡法檢測(cè)OPN,、BSP、Runx2 和 Col I 的蛋白表達(dá),。（d）OPN,、BSP、Runx2和Col I相對(duì)蛋白質(zhì)水平的密度測(cè)定,。（e）通過(guò)ALP染色確定成骨分化,。（f）相對(duì)ALP活性。（g）通過(guò)茜素紅染色形成鈣結(jié)節(jié),。（h）相對(duì)礦化水平,。

總之，這項(xiàng)研究的結(jié)果支持EPCs可以在體外增強(qiáng)MSCs成骨分化的觀點(diǎn),。EPCs對(duì) MSCs的分化和成骨具有深遠(yuǎn)的影響,，EPCs顯著促進(jìn)了MSCs 的成骨基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成也顯著增加,。EPCs的外泌體或旁分泌因子影響MSCs的生物學(xué)功能,，激活p38MAPK通路可能是增強(qiáng)MSCs成骨分化的關(guān)鍵,。對(duì)細(xì)胞相互作用的進(jìn)一步了解對(duì)于理解體外細(xì)胞動(dòng)力學(xué)將是無(wú)價(jià)的，最終有助于更合理的組織工程策略,。

參考文獻(xiàn)：Xu C, Liu H, He Y, Li Y, He X. Endothelial progenitor cells promote osteogenic differentiation in co-cultured with mesenchymal stem cells via the MAPK-dependent pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Dec 11;11(1):537. doi: 10.1186/s13287-020-02056-0. PMID: 33308309; PMCID: PMC7731475.

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