動脈粥樣硬化是一種進行性血管疾病,，其特征是在動脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì),、形成纖維脂質(zhì)斑塊致管壁增厚,、管腔狹窄,。內(nèi)皮細胞（ECs）的單層構(gòu)成血管的內(nèi)膜,，負責(zé)生物力學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管張力的調(diào)節(jié)。ECs功能障礙以內(nèi)皮依賴性血管擴張和血管收縮不平衡為特征,，提示動脈粥樣硬化性病變的起始,。然而，動脈粥樣硬化過程中ECs的詳細轉(zhuǎn)錄圖譜,、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子特征尚不清楚,。

慢性血管炎癥提供了一個促動脈粥樣硬化的微環(huán)境，不斷刺激ECs,，而這種不利條件與西方飲食的增加有關(guān),。在這種微環(huán)境中，分泌的細胞因子如白細胞介素-1β（IL-1β）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的存在促使ECs的表型轉(zhuǎn)變,。這種表型改變稱為內(nèi)皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT）,，間充質(zhì)樣ECs逐漸表達VSMC標志物，從而加重動脈硬化,。

此外,，血管ECs不斷暴露于血流產(chǎn)生的機械刺激（即剪切應(yīng)力），其中不同的剪切模式觸發(fā)不同的細胞反應(yīng),。穩(wěn)定層流剪切應(yīng)力（LSS）可引起抗炎和抗動脈粥樣硬化作用,，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）則對應(yīng)于促炎和促動脈粥樣硬化作用。然而，很少有研究將成熟和功能性ECs與間充質(zhì)樣ECs的遺傳特征進行比較,，特別是在動脈粥樣硬化性疾病的背景下,。

在香港中文大學(xué)李嘉誠健康科學(xué)研究所、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院,、國家衛(wèi)生研究院細胞與系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所的一項研究中,，應(yīng)用scRNA-seq方法（i）探索動脈粥樣硬化過程中主動脈ECs的轉(zhuǎn)錄景觀和異質(zhì)性；（ii）在功能失調(diào)的ECs中鑒定新的和可成藥的分子靶點,；（iii）將新確定的分子靶點與血管系統(tǒng)的病理狀況聯(lián)系起來,；以及（iv）將實驗性動脈粥樣硬化的發(fā)現(xiàn)與人類動脈粥樣硬化疾病臨床標本中的動脈和ECs相關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果將為確定針對動脈粥樣硬化疾病的替代治療策略開辟新的機會,。以下為部分研究成果分享,。

SOX4 在動脈粥樣硬化性主動脈中上調(diào)

由于轉(zhuǎn)錄因子（TFs）代表了真核細胞中各種信號通路的匯合點，因此直接調(diào)節(jié)TFs功能可能為不同疾?。ò▌用}粥樣硬化）提供新的治療見解,。在動脈粥樣硬化主動脈中，僅在EC和VSMC簇中檢測到TF Sox4的上調(diào)（圖1 A）,。盡管在動脈粥樣硬化主動脈的EC中也注意到Tcf4上調(diào)（圖1 A）,，但其在多個細胞簇中的復(fù)雜表達變化表明，Tcf4可能參與多個細胞過程,，但不僅僅參與動脈粥樣硬化期間的EC功能,。為了解開這些TFs下游的效應(yīng)基因，進行了相互作用組分析,。此外,，SOX4是某些間充質(zhì)標志物（即VIM和FN1）的直接上游調(diào)節(jié)因子，如基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析所示（圖1 B）,。在WD喂養(yǎng)的ApoE^?/? 小鼠主動脈根部和人動脈粥樣硬化冠狀動脈和腎動脈中,，分別在斑塊區(qū)和EC層觀察到SOX4上調(diào)（圖1 C、E）,。這種上調(diào)伴隨著小鼠主動脈和人動脈粥樣硬化腎動脈分離的ECs中內(nèi)皮標志物（即eNOS和PECAM-1）的丟失和間充質(zhì)標志物（即VIM）的增加（圖1 D,、F）。

圖1   人和小鼠動脈粥樣硬化主動脈中的內(nèi)皮SOX4上調(diào),。

（A）不同主動脈細胞中轉(zhuǎn)錄因子Sox4和Tcf4表達的圖,。（B）SOX4與其他蛋白質(zhì)相互作用組的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。（C）動脈粥樣硬化病變上的油紅O染色和ApoE-/- 小鼠主動脈根部SOX4表達的免疫組織化學(xué)染色,。（D）來自ApoE?/? 小鼠分離的ECs的SOX4,，內(nèi)皮標志物（即eNOS和PECAM-1）和間充質(zhì)標志物（即VIM）的蛋白質(zhì)印跡表達水平。（E）人患病冠狀動脈和對照胸內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞中SOX4的免疫熒光染色水平,。（F）人腎動脈內(nèi)皮（PECAM-1）和間充質(zhì)（VIM）標志物水平的免疫熒光染色,。ND：正常飲食；WD：西方飲食。

SOX4過表達的促動脈粥樣硬化和促EndoMT 效應(yīng)

為了了解SOX4在動脈粥樣硬化中的作用,，在WD喂養(yǎng)前,，將內(nèi)皮特異性AAV-SOX4注射到ApoE?/? 小鼠。結(jié)果表明,，SOX4過表達增加了ApoE?/? 小鼠主動脈中SOX4蛋白的表達（圖2 A）,。SOX4過表達增加了ApoE?/? 小鼠面主動脈和主動脈根部的病變區(qū)域（圖2 B、C）,。此外,，SOX4過表達導(dǎo)致分離的ECs和主動脈根部的內(nèi)皮標志物（即eNOS和PECAM-1）丟失和間充質(zhì)標志物（即VIM）的增加（圖2 A、D）,。而且,，體外腺病毒介導(dǎo)的SOX4過表達在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）中引起類似的結(jié)果（圖2 E-G）。與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)一致（圖1 B）,，SOX4過表達增強了ECs中的VIM水平,。

此外，實驗還研究了SOX4過表達對ECs形態(tài)和功能的影響,。這種過表達觸發(fā)了HUVECs和HAECs的伸長（圖2 H）,，以及小鼠主動脈內(nèi)皮依賴性松弛的損害（圖2 I），表示結(jié)構(gòu)改變和內(nèi)皮功能障礙,。這些證據(jù)暗示了SOX4的促動脈粥樣硬化作用,，這與SOX4介導(dǎo)的EndoMT有關(guān),。

圖2   SOX4在內(nèi)皮細胞中的過表達,。

（A）ApoE?/? 小鼠分離的ECs的蛋白質(zhì)印跡，先前接受尾靜脈注射內(nèi)皮特異性AAV-SOX4,。（B,、C）注射AAV-SOX4的ApoE?/? 小鼠的（B）面主動脈和（C）主動脈根部動脈粥樣硬化病變的油紅色O染色。（D）小鼠主動脈根部內(nèi)皮和間充質(zhì)標志物的免疫熒光染色,。（E,、F）在 Ad-SOX4 處理的（E）HUVECs 和（F）HAECs 上進行蛋白質(zhì)印跡。（G）對Ad-SOX4感染的HUVECs的內(nèi)皮和間充質(zhì)標志物進行免疫熒光染色,。（H）經(jīng)Ad-SOX4處理的HUVECs的形態(tài),。（I）通過線肌圖對Ad-SOX4感染的C57BL / 6小鼠主動脈進行內(nèi)皮依賴性松弛的功能測定。

二甲雙胍抑制細胞因子介導(dǎo)的SOX4上調(diào)

接下來,，實驗旨在揭示SOX4的潛在誘導(dǎo)因子和抑制因子,。值得注意的是，西方飲食模式通常與更高水平的循環(huán)細胞因子（例如IL-1β）相關(guān),，IL-1β和TGF-β1都是動脈粥樣硬化期間EndoMT誘導(dǎo)的細胞因子,。此外，SOX4先前已被證明是免疫細胞（例如T細胞）中這兩種細胞因子的下游靶點。因此,，實驗想知道IL-1β和TGF-β1是否作為內(nèi)皮細胞中SOX4介導(dǎo)的EndoMT的上游啟動因子,。事實上，用IL-1β（10 ng ml?1）進行體外孵育可誘導(dǎo)人腎動脈和 ApoE?/? 小鼠主動脈中的 SOX4 上調(diào)和 EndoMT（圖3 A-C）,。然后進一步驗證了暴露于IL-1β和TGF-β1（另一種EndoMT誘導(dǎo)細胞因子）的HUVECs的結(jié)果,。兩種細胞因子的共同處理顯著增加了HUVECs中的SOX4蛋白表達和EndoMT（圖3 D）。更重要的是,，用抗糖尿病藥物二甲雙胍處理,，先前報道是癌中的 SOX4抑制劑，逆轉(zhuǎn)了細胞因子誘導(dǎo)的HUVECs中SOX4表達和EndoMT的升高（圖3 D）,。更重要的是,，siRNA介導(dǎo)的SOX4敲低也逆轉(zhuǎn)了HUVECs中細胞因子誘導(dǎo)的EndoMT（圖3 E）。

圖3   SOX4上調(diào)的生化誘導(dǎo)因子,。

（A）IL-1β處理的人腎動脈SOX4表達的免疫組織化學(xué)染色,。（B）IL-1β處理的人腎動脈上的蛋白質(zhì)印跡。（C）IL-1β 處理的 ApoE?/? 小鼠主動脈的蛋白質(zhì)印跡,。（D）二甲雙胍在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響,。（E）siRNA介導(dǎo)的SOX4敲低在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響。

OSS 誘導(dǎo)的 SOX4 上調(diào)

動脈粥樣硬化斑塊和動脈瘤往往發(fā)生在暴露于血流紊亂的血管區(qū)域,。由于OSS經(jīng)歷區(qū)域（例如小鼠主動脈根部）中的SOX4表達很高（圖1 C）,，實驗假設(shè)除了細胞因子介導(dǎo)的生化刺激外，SOX4可能對血流誘導(dǎo)的機械刺激敏感,。由于相對直的TA和彎曲的AA分別對應(yīng)于LSS（12?dyn cm2）和OSS（0.5 ± 6?dyn cm2,，1 Hz）（圖4 A），實驗檢查了這些血管區(qū)域的SOX4水平,。位于AA內(nèi)曲率的ECs中的SOX4表達增加（圖4 B）,，同時AA的整體SOX4表達也較高（圖4 C）。然后進一步驗證了在體外受血流動力學(xué)力作用的HUVECs的結(jié)果（圖4 D）,。暴露于OSS（0.5 ± 6?dyn cm2,，1 Hz）24小時后，HUVECs的SOX4水平在轉(zhuǎn)錄和翻譯上均升高（圖4 E）,，與體內(nèi)結(jié)果一致,。

圖4   SOX4上調(diào)的生物力學(xué)誘導(dǎo)因子。

（A）沿主動脈的不同流動模式示意圖,。（B）小鼠胸主動脈（TA）和主動脈弓（AA）的面部SOX4表達的免疫熒光染色,。（C）小鼠TA和AA中SOX4水平的蛋白質(zhì)印跡。（D）流動系統(tǒng)設(shè)計示意圖和細胞室橫截面,。（E）暴露于LSS或OSS 24小時的HUVECs中SOX4水平的蛋白質(zhì)印跡,。

圖5   圖形概要

高脂血癥相關(guān)的細胞因子和紊亂的血流上調(diào)ECs中SOX4的表達,，其中SOX4促進EndoMT和動脈粥樣硬化發(fā)生。 二甲雙胍在藥理學(xué)上抑制ECs中的SOX4水平,。

綜上所述,，該研究揭示了小鼠動脈粥樣硬化主動脈的細胞組成和轉(zhuǎn)錄譜，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄和細胞異質(zhì)性將ECs分為兩個亞群,。此外,，SOX4被成功鑒定為人類和小鼠動脈粥樣硬化的新標志物。高脂血癥相關(guān)細胞因子和流體剪切應(yīng)力被確定為介導(dǎo)SOX4上調(diào)的上游刺激,，從而為SOX4加速動脈粥樣硬化進展提供了機制見解,。二甲雙胍被證明可以抑制細胞因子誘導(dǎo)的SOX4上調(diào)，為動脈粥樣硬化疾病開辟了新的治療機會,。

參考文獻：Cheng CK, Lin X, Pu Y, Tse JKY, Wang Y, Zhang CL, Cao X, Lau CW, Huang J, He L, Luo JY, Shih YT, Wan S, Ng CF, Wang L, Ma RCW, Chiu JJ, Chan TF, Yu Tian X, Huang Y. SOX4 is a novel phenotypic regulator of endothelial cells in atherosclerosis revealed by single-cell analysis. J Adv Res. 2023 Jan;43:187-203. doi: 10.1016/j.jare.2022.02.017. Epub 2022 Mar 1. PMID: 36585108.

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