幾十年來，糖尿病及其臨床并發(fā)癥（如糖尿病腎病和冠狀動脈疾?。┑娜蚧疾÷屎退劳雎室恢痹谏仙?。值得注意的是，內(nèi)皮功能障礙,、氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病和心血管疾病發(fā)展中的相互關(guān)聯(lián)的因素,。活性氧（ROS）的增加會加重血管炎癥,，反之亦然,。增強的氧化和炎癥負(fù)荷會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。

miRNAs 是一類短的非編碼 RNAs（約 22 個核苷酸）,，負(fù)責(zé)不同細(xì)胞過程中的基因調(diào)控,。在 miR-181 家族成員（miR-181a、miR-181b,、miR-181c 和 miR-181d）中,，發(fā)現(xiàn) miR-181b 與 2 型糖尿病患者血漿中的血管炎癥和血栓形成呈負(fù)相關(guān)。然而,，miR-181b 是否在糖尿病進(jìn)展過程中在血管細(xì)胞中異常表達(dá),，以及 miR-181b 上調(diào)是否能改善糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙仍不清楚。

AMP 活化蛋白激酶（AMPK）是真核生物中的關(guān)鍵參與者,，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)能量代謝,。此外，AMPK 激活被證明是內(nèi)皮細(xì)胞中 miRNA 生物發(fā)生的上游事件,，其中 AMPK 可以磷酸化細(xì)胞核中的核仁素以調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá),。研究 AMPK 激活是否通過靶向 miRNAs 來改善內(nèi)皮功能將是有意義的。

某些 miRNAs 被認(rèn)為是機械敏感的,，因為它們在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)在暴露于不同的剪切模式時會發(fā)生改變,。因此，剪切應(yīng)力介導(dǎo)的 miRNA 表達(dá)改變部分有助于內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),。此外,，暴露于剪切應(yīng)力可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK 激活。

在香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系,、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院,、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合學(xué)系等聯(lián)合團隊的一項項研究中，探討了（i）研究糖尿病患者動脈組織中 miR-181b 的水平,；（ii）研究 miR-181b 上調(diào)是否對糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙具有保護(hù)作用,；（iii）確定 miR-181b 的潛在分子機制和上游誘導(dǎo)因子。

糖尿病患者中 miR-181b 表達(dá)降低

為了評估糖尿病條件下血管中 miR-181b 的表達(dá),，實驗首先測量并比較了非糖尿病患者和糖尿病患者腎動脈中的 miR-181b 水平,。結(jié)果表明，與非糖尿病患者相比,，糖尿病患者腎動脈中 miR-181b 的表達(dá)顯著降低（圖1 A）,。接下來試圖確定哪種糖尿病風(fēng)險因素會調(diào)節(jié) miR-181b 的表達(dá)。在糖尿病期間,，AGEs 水平升高,，因為蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在暴露于糖時被糖化,。AGEs 的積累會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和炎癥。因此,，實驗假設(shè) AGEs 下調(diào)動脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的 miR-181b,。正如所料，AGEs（200 μg mL-1）的添加抑制非糖尿病患者腎動脈中 miR-181b 的表達(dá)（圖1 B）,，以及在 HUVECs（圖1 C）,。

圖1   miR-181b在人腎動脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。

（A）對非糖尿病和糖尿病患者腎動脈中的  miR-181b 水平進(jìn)行 RT-PCR 檢測,，（B）對接受 AGEs 200 μg mL-1 處理12小時的非糖尿病患者在腎動脈中的 miR-181b 水平進(jìn)行 RT-PCR 檢測,。（C）RT-PCR 檢測HUVECs 中用200 μg mL?1 AGEs處理12小時的miR-181b表達(dá)。

實驗接下來研究了 miR-181b 在糖尿病條件下血管系統(tǒng)中的作用,，從正常食物喂養(yǎng)小鼠和糖尿病小鼠中解剖主動脈,，對ACh進(jìn)行功能測定，作為內(nèi)皮功能的指征,，結(jié)果表明,，miR-181b 過表達(dá)改善糖尿病小鼠主動脈的內(nèi)皮功能。

然后研究了 miR-181b 過表達(dá)如何改善糖尿病小鼠血管系統(tǒng)的內(nèi)皮功能,。由于 NO 和 ROS之間的不平衡會加重內(nèi)皮功能障礙,，實驗假設(shè) miR-181b 可能會抑制 ROS 過度產(chǎn)生以改善糖尿病狀態(tài)下的內(nèi)皮功能。因此,，進(jìn)行了光澤精增強化學(xué)發(fā)光法和 DHE 染色,，以確定糖尿病小鼠主動脈中 ROS 的產(chǎn)生。實驗發(fā)現(xiàn)表明,，miR-181b 過表達(dá)抑制糖尿病小鼠主動脈血管 ROS,，而且miR-181b 可能部分介導(dǎo) AMPK 在糖尿病條件下血管系統(tǒng)中的抗氧化作用。

實驗還假設(shè) miR-181b 通過抑制血管炎癥來改善內(nèi)皮功能,，因為多種炎癥機制會觸發(fā)內(nèi)皮激活和功能障礙,，從而加劇心血管疾病的進(jìn)展。因此,，研究了糖尿病條件下小鼠主動脈（即 Icam1,、Vcam1 和 Il-6）和培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞（即 ICAM1、VCAM1 和 IL-6）中常見炎癥標(biāo)志物的表達(dá),。結(jié)果表明,，miR-181b 過表達(dá)抑制血管和內(nèi)皮炎癥，這些發(fā)現(xiàn)還暗示 AMPK 的激活可部分通過 miR-181b 在血管系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)抗炎作用,。

AMPK 激活增加人動脈和內(nèi)皮細(xì)胞中 miR-181b 的表達(dá)

實驗已經(jīng)證明 miR-181b 抑制劑的存在消除了 AMPK 激活劑 AICAR 的血管松弛,、抗氧化和抗炎作用。為了進(jìn)一步驗證實驗的假設(shè),，即 AMPK 激活上調(diào) miR-181b 在動脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),，用 AICAR 處理了人腎動脈和 HUVECs,。AICAR（2 mmol L-1）的存在上調(diào)了非糖尿病患者腎動脈中 miR-181b 的水平（圖2 A），以及在 HUVECs中（圖2 B）,。此外,，AMPK 抑制劑 ara-A（1 mmol L-1）的存在逆轉(zhuǎn)了 HUVECs 中 AICAR 對 miR-181b 的上調(diào)作用（圖2 C）,。這些結(jié)果表明,，內(nèi)皮細(xì)胞中存在 AMPK/miR-181b 軸。

圖2   AMPK活化對人動脈和內(nèi)皮細(xì)胞miR-181b水平的影響,。

（A）RT-PCR檢測miR-181b在AICAR治療的非糖尿病患者腎動脈中的表達(dá),。（B）RT-PCR檢測 AICAR 對 HUVECs 中 miR-181b 表達(dá)的時間依賴性影響。（C） RT-PCR檢測1 mmol L?1 ara-A 處理 HUVECs 12 h后miR-181b水平,。

長期運動激活糖尿病小鼠的 AMPK/miR-181b 軸

實驗接下來試圖確定在糖尿病條件下可以激活血管系統(tǒng)中 AMPK/miR-181b 軸的潛在方法,。運動通常被認(rèn)為對糖尿病患者的心血管健康有益，而長期運動先前已被證明可激活糖尿病小鼠動脈中的 AMPK,。因此,，假設(shè)長期運動可以通過 AMPK 激活增加動脈中 miR-181b 的表達(dá)。因此,，讓非糖尿病 db/m小鼠和糖尿病 db/db 小鼠在電動跑步機上進(jìn)行運動（圖 3 A）,，使用另一種 2 型糖尿病小鼠模型來確認(rèn)運動時 AMPK/miR-181b 軸的存在。與久坐組相比,，長期運動在 db/m 和 db/db 小鼠的主動脈中誘導(dǎo) AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖3 B-D）,。注射 AMPK 抑制劑化合物C（20 mg kg-1）可消除運動訓(xùn)練的 db/db 小鼠主動脈中的 AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖3 B-D）。這些發(fā)現(xiàn)表明,，長期運動通過 AMPK 激活上調(diào) miR-181b,。

圖3   長期運動對糖尿病小鼠主動脈 AMPK/miR-181b 軸的影響。

（A）糖尿病小鼠長期運動訓(xùn)練的示意圖概述,。（B）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡,，以及（C）在久坐不動或經(jīng)過運動訓(xùn)練的糖尿病小鼠的主動脈中在Thr172處表達(dá)AMPK和p-AMPK的蛋白質(zhì)印跡的定量。（D）RT-PCR檢測在久坐不動或運動訓(xùn)練的糖尿病小鼠的主動脈中的miR-181b表達(dá),。

LSS 激活內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK/miR-181b 軸

運動的好處是由身體中一系列生理,、分子和細(xì)胞過程介導(dǎo)的。在運動過程中,，全身血流量增加,，導(dǎo)致血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更高的剪切應(yīng)力。因此,，推測增加的剪切應(yīng)力可能部分導(dǎo)致了運動期間內(nèi)皮細(xì)胞中 AMPK/miR-181b 軸的激活,。為了驗證，進(jìn)行了體外血流動力學(xué)研究來模擬人內(nèi)皮細(xì)胞上增加的剪切應(yīng)力（即 LSS）（圖4 A）,。暴露于 LSS（12 dyn/ cm2）12 小時可誘導(dǎo) HUVECs 中的 AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖4 B-D）,。同時,，AMPK 抑制劑 ara-A（1 mmol L-1）的存在抑制了 HUVECs 中 AMPK 的激活和 miR-181b 的上調(diào)（圖4 B-D），暗示內(nèi)皮細(xì)胞中存在 LSS/AMPK/miR-181b 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸,。

圖4   LSS對內(nèi)皮細(xì)胞中 AMPK/miR-181b 軸的影響,。

（A）流動系統(tǒng)示意圖。（B）AMPK and p-AMPK 具有代表性的蛋白質(zhì)印跡,，以及（C）在暴露于LSS 12 h的HUVECs中在THr172位點下表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡的定量,。（D）RT-PCR檢測 miR-181b在LSS暴露 的HUVECs中的表達(dá)。

總之,，該研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的動脈中 miR-181b 水平降低,。miR-181b 可減輕糖尿病小鼠的內(nèi)皮功能障礙、血管炎癥和氧化應(yīng)激,。AMPK 激活上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中的 miR-181b 水平,。此外，長期運動可能通過增加血流量來激活內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK/miR-181b 軸,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，AMPK/miR-181b 軸對糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙具有有益作用。

參考文獻(xiàn)：Cheng CK, Shang W, Liu J, Cheang WS, Wang Y, Xiang L, Lau CW, Luo JY, Ng CF, Huang Y, Wang L. Activation of AMPK/miR-181b Axis Alleviates Endothelial Dysfunction and Vascular Inflammation in Diabetic Mice. Antioxidants (Basel). 2022 Jun 9;11(6):1137. doi: 10.3390/antiox11061137. PMID: 35740034; PMCID: PMC9220246.

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