成骨細(xì)胞是骨組織中高度分化的細(xì)胞,，來源于間充質(zhì)譜系,。它們的主要功能是產(chǎn)生稱為類骨質(zhì)的膠原物質(zhì)，隨后被礦化形成成熟的骨骼,。已知成骨細(xì)胞在其自身譜系（即骨祖細(xì)胞,、骨襯細(xì)胞和骨細(xì)胞）內(nèi)的不同分化階段與其他細(xì)胞交流,。然而，最近的研究表明,，成骨細(xì)胞也與其他骨骼細(xì)胞類型交流,，特別是關(guān)節(jié)軟骨中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

近年來,，骨-軟骨串?dāng)_的概念引起了人們的極大關(guān)注,，特別是在關(guān)節(jié)損傷和疾病方面。對骨組織的直接機(jī)械損傷似乎可能通過骨-軟骨串?dāng)_間接影響軟骨組織,。

骨細(xì)胞感知其物理機(jī)械環(huán)境變化的主要方式之一是通過沿其基質(zhì)表面以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的腔隙-小管系統(tǒng)（LCS）內(nèi)的流體運(yùn)動,。這允許產(chǎn)生間質(zhì)流體流動剪切應(yīng)力（FFSS），其大小可以根據(jù)局部微觀解剖結(jié)構(gòu)的變化而變化,。機(jī)械刺激對骨骼和軟骨細(xì)胞的影響,，以及它們之間產(chǎn)生的串?dāng)_，是理解創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎（PTOA）等疾病的重要因素,。然而,，這種雙組織系統(tǒng)在受控的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中研究也更加復(fù)雜，因此新的方法和模型系統(tǒng)對于實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)非常重要,。

愛爾蘭huangjia外科醫(yī)學(xué)院（RCSI）醫(yī)學(xué)和健康科學(xué)大學(xué),、都柏林大學(xué)圣三一學(xué)院、愛爾蘭科學(xué)基金會（SFI）先進(jìn)材料與生物工程研究中心實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊曾作過一項(xiàng)研究,，主要目的是開發(fā)和表征體外骨-軟骨串?dāng)_系統(tǒng)及其對FFSS的反應(yīng)能力,。具體而言，他們評估了振蕩流體流動通過暴露于預(yù)定水平的FFSS對小鼠成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的影響,，還研究了受刺激成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基對軟骨細(xì)胞的影響,。其次要目的是在這項(xiàng)工作中評估細(xì)胞系和原代細(xì)胞之間的差異，比較了永生化成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞系（分別為MC3T3-E1和ATDC5）在不同FFSS水平作用下對其原代對應(yīng)物的反應(yīng),。最后,，證明了來自機(jī)械刺激受損的原代成骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的可溶性信號可以改變原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表型。

流體流動剪切應(yīng)力（FFSS）對原代和細(xì)胞系成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

將0.5-3.5 Pa范圍內(nèi)的振蕩FFSS應(yīng)用于細(xì)胞系和原代成骨細(xì)胞群（分別為MC3T3和MSC-OB）,。兩種細(xì)胞類型在FFSS刺激至1 Pa 時,，ALP和鈣的水平顯著上升（圖1 A、B）,。然而,，在大于1 Pa時，ALP和鈣水平均逐漸下降,。此外,，在大多數(shù)情況下，與MC3T3s相比，MSC-OB組中的ALP和鈣水平顯著更高,，表明原代細(xì)胞對這種刺激的反應(yīng)比它們的細(xì)胞系對應(yīng)物更強(qiáng)烈,。

圖1    不同水平的FFSS對MSC-OBs和MC3T3s在ALP，鈣和成骨基因表達(dá)方面的影響,。（A）兩種細(xì)胞類型的ALP水平在預(yù)定的FFSS水平下,，歸一化為DNA含量。（B）兩種細(xì)胞類型中的鈣水平在預(yù)定的FFSS水平下,，歸一化為DNA含量,。（C） 通過RT-PCR測定MSC-OB細(xì)胞中 Collagen、ALP,、OCN,、OPN、RUNX2 mRNA的基因表達(dá)水平,。

圖1 A,、B在ALP和鈣水平方面表現(xiàn)出非常一致的趨勢。此外,，這兩個因素在原代細(xì)胞中的峰值水平均為1 Pa,，這正是它們原位暴露的FFSS的大小。同樣,，基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示,，對于所檢查的所有成骨因子（OPN除外），峰值水平也為1 Pa,。在大多數(shù)情況下,，與細(xì)胞系對應(yīng)物相比，原代細(xì)胞的反應(yīng)幅度更大,。此外,，除了OPN在這個水平上略有增加，大多數(shù)被測量的基因在較高水平的FFSS（3-3.5 Pa）下顯示出顯著降低的表達(dá),。

接下來，進(jìn)一步研究以確定和優(yōu)化振蕩流參數(shù)的頻率和持續(xù)時間對原代細(xì)胞的刺激（1 Pa）和損傷（3 Pa）機(jī)制的影響（圖2）,。刺激狀態(tài)下使用的FFSS產(chǎn)生合成代謝反應(yīng),，而破壞狀態(tài)下產(chǎn)生更多的分解代謝反應(yīng)，去分化和肥大標(biāo)記物增加,。隨著頻率和持續(xù)時間的變化,，在檢查的每個頻率（1和2 Hz）和每個時間點(diǎn)（1、2和4小時）上,，1和3 Pa之間存在顯著差異,。研究還發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)時間點(diǎn)，特別是在較長的持續(xù)時間下,，2 Hz時的表達(dá)水平比1 Hz時有所下降,。此外，每種細(xì)胞類型的鈣含量和Col I,、RUNX2和OPN水平隨著時間的推移相對穩(wěn)定,。

圖2   FFSS條件下的頻率和持續(xù)時間對1和3 Pa的MSC-OBs在ALP，鈣和成骨基因表達(dá)方面的影響,。

（A）已歸一化為DNA含量的ALP水平,。（B）鈣水平歸一化為DNA含量。（C） 通過 RT-PCR 檢測 MSC-Obs 中 Collagen I,、ALP,、OCN、OPN和 RUNX2 mRNA 的基因表達(dá)水平,。

FFSS對軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響

與無流動對照相比,，原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（ACs）對FFSS的反應(yīng)也有明顯變化（圖3）。細(xì)胞以與先前實(shí)驗(yàn)類似的方式暴露于FFSS（0-3.5 Pa）,。最初,，AC和ATDC5細(xì)胞之間的sGAG含量沒有顯著差異。然而,，1 Pa似乎代表了一個閾值水平,，該參數(shù)在原代軟骨細(xì)胞中達(dá)到峰值。在所有較高的FFSS量級上,，sGAG（人硫酸鹽粘多糖）水平逐漸降低,。基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示,，Col II,，AGG和Sox9表達(dá)水平也在1 Pa時達(dá)到峰值，但在不同細(xì)胞類型之間存在明顯差異,。相比之下,，Col I 和 Col X 分別在 2/3 Pa 時達(dá)到峰值。在所有情況下,，與細(xì)胞系對應(yīng)物相比,，原代軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的反應(yīng)。

圖3   不同水平的FFSS對原代ACs和ATDC5細(xì)胞的影響,。

（A）兩種細(xì)胞類型的sGAG水平歸一化為DNA含量,。（B） 通過 RT-PCR 檢測 I 型、II 型和 X 型膠原,、SOX9 和蛋白聚糖 mRNA 的基因表達(dá)水平,。

基于圖3的數(shù)據(jù)，然后使用刺激性（1 Pa）和破壞性（2 Pa）模型來確定原發(fā)性ACs如何對頻率和持續(xù)時間的變化做出反應(yīng)（圖4）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，在每個應(yīng)力水平下,，增加頻率和持續(xù)時間往往會降低sGAG含量和Col II、AGG和SOX9表達(dá),，相比之下,，在相同條件下會增加肥厚標(biāo)記Col X和Col I的表達(dá)。

圖4   FFSS條件在1和2 Pa下對原代ACs的頻率和持續(xù)時間對sGAG和基因表達(dá)的影響,。（A） AC sGAG水平與DNA含量歸一化,。（B） 通過 RT-PCR 檢測 ACs  I 型、II 型和 X 型膠原蛋白和 SOX9 的基因表達(dá)水平,。

FFSS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞衍生的可溶因子對軟骨細(xì)胞的影響

最后,，通過使用條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)來確定FFSS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞衍生的可溶因子對軟骨細(xì)胞表型的影響。圖5表明,，在刺激性 FFSS 水平（即 1 Pa）下,，可溶性成骨細(xì)胞衍生因子導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中 sGAG 的產(chǎn)生與對照水平相比增加。然而,，在2,、3和3.5 Pa處響應(yīng)FFSS產(chǎn)生的可溶性因子導(dǎo)致sGAG含量較對照和峰水平降低，并且在基因水平上蛋白聚糖也發(fā)現(xiàn)了這種效應(yīng),。令人驚訝的是,，Col II基因在1 Pa時表達(dá)量的增加在該系統(tǒng)中并不明顯，并且對照組在2,、3和3.5 Pa時的表達(dá)量與之前一樣,。同樣，與高FFSS水平的對照組相比,，SOX9的表達(dá)也減少了,。Col I在2 Pa時表達(dá)量無顯著增加，而在3和3.5 Pa時表達(dá)量較1 Pa時減少,。在Col X的情況下,，表達(dá)譜與Col I有些相似，峰值為1 Pa,，隨后在3和3.5 Pa處顯著降低,。

這些數(shù)據(jù)表明，暴露于受刺激的成骨細(xì)胞衍生因子可能對AC表型產(chǎn)生顯著的幅度依賴性影響,。

圖5   FFSS 誘導(dǎo)的可溶性成骨細(xì)胞衍生因子引起的軟骨細(xì)胞表型變化。

（A）暴露于FFSS誘導(dǎo)的可溶性成骨細(xì)胞衍生因子后,，ACs中的sGAG水平歸一化為DNA含量,。（B） 在暴露于條件培養(yǎng)基后 3 天后ACs 膠原 I、II 和 X 膠原蛋白、SOX9 和蛋白聚糖的基因表達(dá),。

總之,，該研究開發(fā)了一種基于原代細(xì)胞的新型系統(tǒng)，可用于概括關(guān)節(jié)損傷后的成骨細(xì)胞損傷應(yīng)激,，以及隨后可能通過骨-軟骨串?dāng)_對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的有害影響,。將來，參與該過程的具體途徑可用于確定在軟骨細(xì)胞中產(chǎn)生分解代謝影響的骨源性因子,。這些信息還可以為PTOA和其他相關(guān)疾病的新型骨靶向生物學(xué)治療提供信息,。

參考文獻(xiàn)：Hinton PV, Genoud KJ, Early JO, O'Brien FJ, Kennedy OD. Impact of Fluid Flow Shear Stress on Osteoblast Differentiation and Cross-Talk with Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2022 Aug 22;23(16):9505. doi: 10.3390/ijms23169505. PMID: 36012760; PMCID: PMC9408926.

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