過氧化物酶(Peroxidase,，POD)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,，具有消除過氧化氫和酚類,、胺類毒性的雙重作用。

測定原理：

POD 催化 H₂O₂ 氧化特定底物,，在 470nm 有特征光吸收,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑一：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存,；用時加入 3mL 試劑一充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃保存；試劑三：液體 3 mL×1 瓶,，4℃保存,。

粗酶液提取：

1,、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復 30 次）,； 8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 470nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 測定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上,。

3,、 樣本測定表

在微量石英比色皿或 96 孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時,，記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2,。計算 ΔA＝A2-A1。

注意：

1,、若一次性測定樣本較多,，可將試劑一、二,、三和蒸餾水按比例配成混合液,，在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上，測定時加入 10µL 樣本和 240µL 混合液測

定,。

2,、如果 ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時間延長到 5min,。如果 ΔA 大于 0.5,，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

POD 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

計算公式：

POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =2500×ΔA 2,、組織,、細菌或細胞 POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =2500×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位,。POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =2500×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位,。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =5×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.25mL,； V 樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V 樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。

用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位,。

POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.005÷T =5000×ΔA 2,、組織、細菌或細胞 POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位,。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =5000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位,。POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =5000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =10×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.25mL,； V 樣：加入樣本體積，0.01mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。