纖維素酶（cellulase,，CL）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

CL（EC 3.2.1.4）存在于細菌、真菌和動物體內(nèi),，能夠催化纖維素降解,，是一類可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品,、棉紡,、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑,。

測定原理：

采用蒽酮比色法測定CL催化纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿,、研缽,、冰、濃硫酸和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑一：液體 6mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑二：液體 40mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃保存； 臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用,。

樣品測定的準備：

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,； 8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1,、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊,，防止水分散失）,，冷卻，620nm 處蒸餾水調(diào)零,，測定吸光值A,，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管設(shè)一個對照管,。

CL 活力計算：

1,、標準條件下測定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462；x 為標準品濃度（mg/mL）,，y 為吸光值,。

2、血清（漿）CL 活力的計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位,。 CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

3,、細胞、細菌和組織中 CL 活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位,。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位,。

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 CL 活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/mL=1000ug/mL,；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1.2mL； V 樣：加入樣本體積,，0.1 mL,；V 樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。