HPLC的分類

HPLC可以分為很多類別，按分離機制可分五種主要類型

1. 液固吸附色譜

以吸附劑為固定相，以不同極性的溶劑為流動相,，根據試樣中各組分吸附能力的不同而進行分離的方法,，稱液相吸附色譜。在HPLC中常用全多空型硅膠微粒為吸附劑,，直徑5-10um,，由于顆粒小且多空，故柱效很高,。

1. 液-液分配色譜

流動相與固定相均為液體的色譜法,，稱液-液分配色譜法或簡稱液-液色譜法，按照固定相和流動相極性的差別,，可分為正相和反相色譜法兩類,。

1. 正相液液色譜法 流動相極性小于固定相的液-液色譜法稱正相液-液色譜法。洗脫時,，極性小的組分先流出色譜柱,，極性打的組分在固定相中溶解度大，后流出色譜柱,。

原始的正相色譜以含水硅膠為固定相,，以乙烷經等為流動相,，由于固定液易流失,，已被化學鍵合色譜法取代，化學鍵合相是將固定液化學鍵鍵合在載體表面形成的固定相,。正相色譜常用的氰基鍵合相,，性質與硅膠的性質差異較大，常用語糖類的分析,。

正相色譜以郵寄溶劑為流動相,，使用成本較高。

1. 反相液-液色譜法 流動相極性大于固定相的液-液色譜法稱反相液-液色譜法,，洗脫時樣品中急性大的組分縣流出色譜柱,。為了防止固定液的流失，反相色譜法均使用化學鍵合相,，典型的反相化學鍵合相,，用多孔載體上化學鍵合的十八烷基為固定相，流動相常用甲醇-水和乙腈-水,。非典型反相色譜系統,，由弱極性或中等極性的鍵合相和極性大于固定相的流動相構成。

反相鍵合色譜法固定相不流失,，流動相以水為主,，用甲醇或乙腈調節(jié)極性，應用范圍很寬，且使用成本低,，用HPLC中應用zui廣,。

一般的反相色譜法，主要用于分離分析非極性和中等極性的化合物,，但用兩種改進的方法,，亦可分離離子化合物。其一為離子對色譜法,，在流動相中加入樣品離子的反粒子,，使其與樣品離子構成不荷電的中性離子對，增加其在非極性固定相中的溶解度,，使分配系數增加,，改善分離效果。分析堿類時可在流動相中加入烷基磺酸鹽(PIC）,，分析酸類則加入四丁基胺磷酸鹽(TBA)等,。這種方法可以使C18柱子一柱多用，用其取代離子交換法,，可避免離子交換法流動相對泵和流路的腐蝕,，缺點是PIC試劑較貴，其二為離子抑制色譜法,，通過調節(jié)流動相的PH,，抑制樣品則分的解離，增加其在固定相中的溶解度,。在流動相中加入醋酸等弱酸,，氨水等弱堿，磷酸鹽及醋酸鹽等緩沖鹽調節(jié)ph即可用于分離有機酸和有機堿,。這種方法比離子對法成本低,，但重復性差，且要注意,，流動相PH應在2-8之間,，超出此范圍可能使鍵合基團脫落、試驗后要及時用不含緩沖鹽的流動相沖洗,，以防腐蝕儀器流路系統,。

1. 離子交換色譜

由于聚苯乙烯樹脂類具膨脹性，不耐壓,，HPLC的離子交換劑多用薄殼形或多孔微粒硅膠為載體,，表面化學鍵合各種離子交換基團，常用的為強酸性磺酸基和強堿型季銨鹽,。一種全多空硅膠為基體的離子交換劑柱效高,，載樣量大,，有較好的耐壓性和理化穩(wěn)定性，但在PH＞9的流動相中硅膠易溶解,，未鍵合的殘留硅純基易生成硅酸鹽,，故只能在PH0-8使用，層析過程中要控制流動相的PH的離子強度

1. 空間排斥（凝膠）色譜

葡聚糖等軟質凝膠在壓強0.1Mpa左右即被壓壞,，不宜在HPLC使用,。由苯乙烯和二乙烯交聯而成的半硬質凝膠注銷較高，常用有機溶劑為流動相,，缺點是具膨脹性,，流動相流經時柱的填充狀態(tài)會發(fā)生變化。以多空硅膠及多孔玻璃珠等無機材料制成的硬質凝膠,，在溶劑中不變形,，但裝柱時易碎，柱效較差,，吸附性較強,，有時易拖尾、

5親和色譜

常用的基質有高度交聯的Sephadex和Bio-geldeng 瓊脂糖凝膠,，大孔徑聚丙烯酰胺凝膠和多孔硅膠,，配基選擇及交換劑合成的原理類似經典親和層析，目前已有許多商品化的親合色譜固定相和色譜柱可供選擇,。

此外,，還有手性固定相HPLC，在生物化學中使用不多,，故不再介紹,。