HPLC的分類

HPLC可以分為很多類別,，按分離機(jī)制可分五種主要類型

1. 液固吸附色譜

以吸附劑為固定相,，以不同極性的溶劑為流動相，根據(jù)試樣中各組分吸附能力的不同而進(jìn)行分離的方法,，稱液相吸附色譜,。在HPLC中常用全多空型硅膠微粒為吸附劑，直徑5-10um,，由于顆粒小且多空,，故柱效很高。

1. 液-液分配色譜

流動相與固定相均為液體的色譜法,，稱液-液分配色譜法或簡稱液-液色譜法,，按照固定相和流動相極性的差別，可分為正相和反相色譜法兩類,。

1. 正相液液色譜法 流動相極性小于固定相的液-液色譜法稱正相液-液色譜法,。洗脫時，極性小的組分先流出色譜柱,，極性打的組分在固定相中溶解度大,，后流出色譜柱。

原始的正相色譜以含水硅膠為固定相,，以乙烷經(jīng)等為流動相,，由于固定液易流失，已被化學(xué)鍵合色譜法取代，化學(xué)鍵合相是將固定液化學(xué)鍵鍵合在載體表面形成的固定相,。正相色譜常用的氰基鍵合相,，性質(zhì)與硅膠的性質(zhì)差異較大，常用語糖類的分析,。

正相色譜以郵寄溶劑為流動相,，使用成本較高。

1. 反相液-液色譜法 流動相極性大于固定相的液-液色譜法稱反相液-液色譜法,，洗脫時樣品中急性大的組分縣流出色譜柱,。為了防止固定液的流失，反相色譜法均使用化學(xué)鍵合相,，典型的反相化學(xué)鍵合相,，用多孔載體上化學(xué)鍵合的十八烷基為固定相，流動相常用甲醇-水和乙腈-水,。非典型反相色譜系統(tǒng),，由弱極性或中等極性的鍵合相和極性大于固定相的流動相構(gòu)成。

反相鍵合色譜法固定相不流失,，流動相以水為主,，用甲醇或乙腈調(diào)節(jié)極性，應(yīng)用范圍很寬,，且使用成本低,，用HPLC中應(yīng)用zui廣。

一般的反相色譜法,，主要用于分離分析非極性和中等極性的化合物,，但用兩種改進(jìn)的方法，亦可分離離子化合物,。其一為離子對色譜法,，在流動相中加入樣品離子的反粒子，使其與樣品離子構(gòu)成不荷電的中性離子對,，增加其在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增加,，改善分離效果,。分析堿類時可在流動相中加入烷基磺酸鹽(PIC），分析酸類則加入四丁基胺磷酸鹽(TBA)等,。這種方法可以使C18柱子一柱多用,，用其取代離子交換法，可避免離子交換法流動相對泵和流路的腐蝕,，缺點(diǎn)是PIC試劑較貴,，其二為離子抑制色譜法，通過調(diào)節(jié)流動相的PH，抑制樣品則分的解離,，增加其在固定相中的溶解度,。在流動相中加入醋酸等弱酸，氨水等弱堿,，磷酸鹽及醋酸鹽等緩沖鹽調(diào)節(jié)ph即可用于分離有機(jī)酸和有機(jī)堿,。這種方法比離子對法成本低，但重復(fù)性差,，且要注意,，流動相PH應(yīng)在2-8之間，超出此范圍可能使鍵合基團(tuán)脫落,、試驗(yàn)后要及時用不含緩沖鹽的流動相沖洗,，以防腐蝕儀器流路系統(tǒng)。

1. 離子交換色譜

由于聚苯乙烯樹脂類具膨脹性,，不耐壓,，HPLC的離子交換劑多用薄殼形或多孔微粒硅膠為載體，表面化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán),，常用的為強(qiáng)酸性磺酸基和強(qiáng)堿型季銨鹽,。一種全多空硅膠為基體的離子交換劑柱效高，載樣量大,，有較好的耐壓性和理化穩(wěn)定性,，但在PH＞9的流動相中硅膠易溶解，未鍵合的殘留硅純基易生成硅酸鹽,，故只能在PH0-8使用,，層析過程中要控制流動相的PH的離子強(qiáng)度

1. 空間排斥（凝膠）色譜

葡聚糖等軟質(zhì)凝膠在壓強(qiáng)0.1Mpa左右即被壓壞，不宜在HPLC使用,。由苯乙烯和二乙烯交聯(lián)而成的半硬質(zhì)凝膠注銷較高,，常用有機(jī)溶劑為流動相，缺點(diǎn)是具膨脹性,，流動相流經(jīng)時柱的填充狀態(tài)會發(fā)生變化,。以多空硅膠及多孔玻璃珠等無機(jī)材料制成的硬質(zhì)凝膠，在溶劑中不變形,，但裝柱時易碎,，柱效較差，吸附性較強(qiáng),，有時易拖尾,、

5親和色譜

常用的基質(zhì)有高度交聯(lián)的Sephadex和Bio-geldeng 瓊脂糖凝膠，大孔徑聚丙烯酰胺凝膠和多孔硅膠,，配基選擇及交換劑合成的原理類似經(jīng)典親和層析,，目前已有許多商品化的親合色譜固定相和色譜柱可供選擇,。

此外，還有手性固定相HPLC,，在生物化學(xué)中使用不多,，故不再介紹。