棕紅色的燃料考馬斯亮藍(lán)G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后,，形成藍(lán)色復(fù)合物，zui大吸光度由465nm變?yōu)?95nm,。在一定蛋白濃度范圍內(nèi),，蛋白和燃料的結(jié)合符合比爾定律（Beer`s Law）。通過(guò)測(cè)定595nm處的光吸收值的增加量,，可對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量測(cè)定,。

溶菌酶是一種N-乙酰細(xì)胞壁質(zhì)聚糖水解酶，該酶可以催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰胺基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵,，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,，從而使細(xì)菌溶解。

本實(shí)驗(yàn)以融壁微球菌（M,lysodeikticus)為底物,，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌懸液濁度的變化（OD)來(lái)測(cè)定溶菌酶的活性,。

所需儀器：

儀器：

721分光光度計(jì)

材料及試劑

1、溶菌酶

2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4).

3,、磷酸二氫鈉（NaH2PO4)

4,、融壁微球菌（M.lysodeikticus)干粉。

5,、氯化鈉（NaCl),。

6、考馬斯亮藍(lán)G-250.

7,、95%乙醇,。

8、85%磷酸,。

9,、牛血清蛋白(BSA).

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑配制

1,、測(cè)活緩沖液,；含30mmol/L，NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,，ph6.2,、

2、底物溶液,；40mg M,lysodeikticus干粉，溶于100mL測(cè)活緩沖液中,。

3,、考馬斯亮藍(lán)G-250試劑；考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中,，加入100ml85%磷酸 ,，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過(guò)濾。（或考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg 溶于50mL 95%乙醇中,，加入100mL 85%磷酸混勻,，配成原液。林用錢取原液15mL,加蒸餾水稀釋至100mL 濾紙過(guò)濾,。

4,、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液；用含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,，PH7.0（緩沖液A)配制1mg/mL 牛血清蛋白溶液,。

蛋白濃度的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定；

取14支試管,，按表3.6-1分兩組進(jìn)行平行操作,。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

測(cè)定位置樣品蛋白濃度

測(cè)定方法同上,。取合適的位置樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi),。根據(jù)所測(cè)定的的A值,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出位置樣品的蛋白質(zhì)濃度,。

酶活力的測(cè)定,；

在室溫下，取2個(gè)試管,，分別在1號(hào)管中加入3.0mL測(cè)活緩沖液,，2.5mL底物溶液；2號(hào)管中加入2.5mL測(cè)活緩沖液,，2.5mL酶液,。以2號(hào)管為對(duì)照，根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間在721分光光度計(jì)上每個(gè)30s測(cè)定1號(hào)650nm處的光吸收值,。按照系列表格記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理：標(biāo)準(zhǔn)品

    酶活力單位（U);酶在溫室PH6.2條件西，OD每分鐘降低0.001為1個(gè)活力單位U,。根據(jù)測(cè)得結(jié)果,，計(jì)算出各步數(shù)據(jù)填入表3.6-3