ATP 含量試劑盒說明書

測定意義：

ATP 廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量 代謝狀態(tài)的主要參數(shù),。測定 ATP 含量并且計算能荷,，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測定原理：

ATP 在 254 nm 下有吸收峰,，可以利用液相色譜法測定其含量,。

需自備的實驗用品：

液相色譜儀、低速離心機(jī),、溶劑抽濾裝置,、針頭式過濾器（水系，50 個，0.22μm）,、濾 膜（水系和有機(jī)系各 1 個,，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）,、可調(diào)式移液器,、樣品瓶（50 個，2mL）,、甲醇（色譜級,，300 mL）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 60mL×1 瓶,，4℃保存,； 

試劑二：液體 60mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑三：粉劑 1×1 瓶,，粉劑 2×1 瓶，4℃保存,；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解 后倒入 1000mL 容量瓶中,，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動相緩沖液基質(zhì)（注：試劑瓶 中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃可保存 1 周,；

試劑四：ATP 標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×1 支,，-20℃保存。臨用前加入 1mL 蒸餾水,，配成 5mg/mL 溶液,， 配好后-20℃可保存 1 周.

實驗前的準(zhǔn)備工作：

1、將蒸餾水 1000 mL,、流動相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 和甲醇 300 mL 用 0.45 μm 的濾膜抽濾,， 以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱,。（注：蒸餾水和緩沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾,，甲醇 用有機(jī)系濾膜抽濾）。

2,、流動相的配制：將抽濾完畢的流動相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 與甲醇配比為 99.9：0.1（v/v）,， 即取 999mL 緩沖液基質(zhì)與 1mL 甲醇混合。

3,、將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 100%的甲醇,， 10%的甲醇，蒸餾水各 250 mL,。 將 2 和 3 中的溶劑超聲 30 分鐘,，以脫去溶劑中的氣泡,，防止堵塞色譜柱。

ATP 的提?。?/span>

1,、組織的處理：準(zhǔn)確稱取組織重量 0.1g，加入 1mL 試劑一,，提取 ATP,， 4000g 常溫離心 15 min，取上清液,，加入等體積的試劑二,，混勻，4000 g 常溫離心 15 min,，取上清,，0.22μm 水系微孔濾膜過濾后冰上放置，待測,。

2,、細(xì)胞處理：收集約 30 mL 細(xì)胞，離心菌體經(jīng)干燥后,，加入 1 mL 試劑一,，超聲破壁細(xì)胞(950 W，30%,，15 min,，工作 1 s 間隔 2 s)，4000 g 常溫離心 15 min,，取上清液,，加入等體積的 試劑二，混勻,，4000 g 常溫離心 15 min,，取上清，0.22μm 水系微孔濾膜過濾后冰上放置,， 待測,。

ATP 含量測定操作步驟：

1. 開啟電腦,、檢測器和泵,，安裝上色譜柱，打開 empower 軟件,，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量 20 μL,，流速 1 mL/min，保留時間 10min,，檢測波長 254nm,設(shè)置完畢保存方法組,。 
2. 用100%的甲醇,、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min,。 
3. 用流動相洗柱子,，待基線穩(wěn)定后開始加樣。 
4. 加入標(biāo)準(zhǔn)品 20 μL,，在 10min 內(nèi)可分離 ATP,， ATP 的保留時間在 3min 左右，（柱子不同,， 保留時間有差異）,，計算不同濃度的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。 
5. 加入樣品 20 μL,，在相應(yīng)保留時間處檢測 ATP 的峰面積,。

ATP 含量的計算：

將5mg/ml 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋成 100 μg/ml、80 μg/ml,、60 μg /ml,、40 μg /ml和20 μg /ml 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo),，峰面積為縱坐標(biāo)分別計 算 ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

   來源于青島捷世康：www.jisskang。,。ｃｏｍ

注：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 ATP 濃度確定,，樣品中 ATP 的峰面積必須落在不同濃 度的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)只是一個參考,。