谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/24 樣

測(cè)定意義

    GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中,，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨 酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過(guò)多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲(chǔ) 存和運(yùn)輸形式,。

測(cè)定原理

    GS 在 ATP 和 Mg²⁺存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺,；谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─ 谷氨?；惲u肟酸,，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物,；該絡(luò)合物在 540nm 處有zui大吸 收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定,。

所需的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì),、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1 mL 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸 餾水,。

試劑的組成和配制

提取液：30mL×1 瓶，4℃保存,。 試劑一：10mL×1 瓶,，-20℃存,。

試劑二：10mL×1 瓶，-20℃存,。

試劑三：粉劑×2 瓶,，-20℃保存。用時(shí)每瓶加入 5mL 蒸餾水充分溶解備用,，用不完的試劑仍 -20℃保存,。

試劑四：10mL×1 瓶，4℃保存,。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

測(cè)定步驟

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm,，蒸餾水零,。 2、在 EP 管中加入下列試劑：

混勻,，靜置 10min 后，5000g,，常溫離心 10min,，取上清液測(cè)定 540nm 處的吸光值 A。△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管,。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管,。

GS 活力單位的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義 為一個(gè)酶活力單位。

GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr

1. 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義為一個(gè) 酶活力單位,。GS（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =19×ΔA÷WV 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.8mL； V 樣：加入樣本體積,，0.14mL,；V 樣總：加入提取液 體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g.

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