檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）抗體的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度,。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘

取上清,。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝，凍存于-20℃,，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

• 酶標儀（450nm）
• 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
• 37℃恒溫箱

操作注意事項

1.   試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。
2.   實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。
3.   濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白,；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度,。
4.   嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。
5.   所有液體組分使用前充分搖勻,。

 試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0,、50、100,、200,、400、800 ng/mL

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1.   手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。
2.   自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.   設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
3.   樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；空白孔不加。
4.   除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.   棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
6.   每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。
7.   每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

結(jié)果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中,，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標,，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能

•  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900,。
•  靈敏度：檢測濃度小于5.0 ng/mL。
•  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應,。
•  重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%。
•  貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。
•  有效期：6個月

免責聲明

•   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗,，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實驗者承擔，本公司概不負責,。
•   嚴格按照說明書操作,，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔,。