一,、產(chǎn)品說明

DNA 在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破環(huán),磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破環(huán)或脫落,便可進一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂,。將細胞固定于低熔點瓊脂糖中,取少量細胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細胞膜,再用堿溶液使 DNA 分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,DNA 分子向陽極移動,。如果 DNA 損傷嚴重,碎片多,則電泳速度快,。未受損傷的 DNA 大分子則由于細胞膜的阻隔,滯留在原處,。用 PI 染色或銀染,可觀察到DNA 受損的細胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關的軟件作定量分析,。

第 3 層凝膠的制備：第 2 層LMA 凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預熱 37℃的 75μL 的 0.7%低溶點瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片 4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍 0.5mm,增加凝膠化作用時間至 30min, 高濕度環(huán)境),。

3,、細胞裂解

移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9mL 加入 1mL 的DMSO),4℃ 裂解 1～2h,取出載玻片用PBS 漂洗。

4,、DNA 堿解旋

將載玻片置于水平電泳槽,。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備 1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過載玻片膠面 0.25cm 左右,室溫放置 20～60min,以便使DNA 在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA 斷鏈在電場中易于遷移。

5,、單細胞電泳

在電壓 25V,電泳 20～30min,電壓,、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。6,、中和與染色

電泳后將載玻片置于平皿內(nèi),。加入 0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)緩沖液,將載玻片沒入,4℃中和三次,每次 10min,棄去 Tris-HCl 緩沖液,每載玻片加 20μL 的 PI 染液或 EB 染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。

7,、觀察,、拍照和分析

熒光顯微鏡 515～560nm 波長的激發(fā)光、PI 染色的DNA 圖象呈紅色,EB 染色的DNA 圖象呈桔紅色, 可清楚地觀察到核DNA 和遷移的DNA(即慧星尾),。每個樣本隨機選擇 100 個細胞,測定核DNA 直徑和DNA 遷移的長度,可并用相應的軟件分析,。