檢測原理

試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被慶大霉素抗原的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品、HRP標記的競爭抗原,，經過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的慶大霉素（Gentamicin）呈負相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

•   試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
•   實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
•   按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍，終結果乘以5才是樣本實際濃度,。
•   嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。
•   所有液體組分使用前充分搖勻,。

試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0,、5、10,、20,、40,、80 PPb

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

•   手工洗板：甩盡孔內液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。
•   自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5次。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.   設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
3.   樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加,。
4.   除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的競爭抗原50μL，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.   棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.   每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7.   每孔加入終止液50μL,，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

1.  15分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值,；

2.  百分結合率計算：設S0管計數(shù)為B0,，各標準管或樣品管計數(shù)為B，非特異管計數(shù)為NSB，則百分結合率計算公式如下：B/B0=(B－NSB)/(B0－NSB)×100%

3.  logit計算:各標準點或樣品管的logit值計算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)

4.  將標準品的OD均值與標準品0點的OD均相除,，為標準點的百分結合率,，在log-logit坐標紙上繪圖。

5.  Log-logit雙對數(shù)標準曲線：坐標紙上橫軸從左至右一個1-9表示為一個10進位,，第二個1-9表示為第二個10進位,。第三個1-9表示為第三個10進位。坐標紙縱軸為百分比（1-99）,，即各標準吸光值的百分結合率,。取一條通過各點的直線。要求盡可能多的點在線上,，同時剩余的點均勻分布在直線的兩邊,。樣品也同樣由吸光值計算百分結合率，再從縱軸上的相應結合率找到直線上的點,，此點對應的橫坐標濃度即為樣品的濃度,，無須換算。

6.  人工處理：以標準濃度取log值為橫坐標,，對應的logit值為縱坐標在普通坐標紙上或以標準濃度為橫坐標,，對應的B/B0為縱坐標在logit-log坐標紙上畫出標準曲線（理想化時是一條直線）。根據(jù)待測樣

品的B/B0可以從坐標紙上查出樣品的濃度值,。如果使用普通坐標紙,，查出的數(shù)值應取反對數(shù)才是后的濃度值。

7.  自動處理：使用logit-log或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式,，由電腦自動計算得出結果,。

8.  敏感度：1.0 PPb

9.  圖例

試劑盒性能

•  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900,。
•  靈敏度：低檢測濃度小于0.1 PPb,。
•  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
•  重復性：板內,、板間變異系數(shù)均小于15%,。
•  貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
•  有效期：6個月

免責聲明

•   試劑盒僅供研究使用,，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果,，由實驗者承擔，本公司概不負責,。
•   嚴格按照說明書操作,，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。