NP-40 裂解液

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

    多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如 Triton,、SDS,、NP-40 等。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液,。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE 電泳,、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，并含有多種蛋白酶抑制劑成分,，可有效抑制蛋白的降解,，并維持原有的蛋白間相互作用。

    Jisskang NP-40 Lysis Buffer 主要由Tris-HCl,、NaCl,、NP-40 以及sodium pyropho-sphate，β-glycerophosphate,，sodium fluoride, EDTA等多種蛋白酶抑制劑組成,。用NP-40 Lysis Buffer得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量試劑盒和Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,。

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1,、取NP-40 Lysis Buffer置于室溫溶解混勻，加入PMSF,，使PMSF終濃度為 1mM,。

2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS,、NS 或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗1次,，低速離心，棄上清,，留取沉淀,。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例,，加入NP-40 LysisBuffer ,。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。置于冰上或4℃裂解15～30min,，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解,。

4,、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

5,、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1,、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入 PMSF,，使 PMSF 終濃度為 1mM,。低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清,，收集沉淀,。

2、用手指輕彈細(xì)胞,，使其松散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer ,。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。

3、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī),，室溫下離心亦可),，取上清。

4,、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(三)組織樣本

1,、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入 PMSF,，使 PMSF 終濃度為 1mM,。把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好,。

2,、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨,，研磨過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解。

3,、按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液,。冰上或4℃裂解30～60min。

4,、步驟3,、4亦可以采用如下過(guò)程：按照每 20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer,。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,，直至充分裂解，該過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解。

5,、10000～12000g,，4℃離心5～15min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可),，取上清,。

6、進(jìn)行后續(xù)的 PAGE,、Western,、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項(xiàng)：

1、在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中,，去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后,，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗,。

2,、如果裂解丌充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當(dāng)減少裂解液的用量,。

3、在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中,，如果細(xì)胞量較多,，必需分裝成 50～100 萬(wàn)細(xì)胞/離心管，然后再裂解,。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分,，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分,。

4,、如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,，通過(guò)強(qiáng)烈 Vortex使樣品裂解充分,。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是丌如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

5,、溶解 Leagene NP-40 Lysis Buffer 時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間,，避免裂解液中的有效成分失效,。

6、細(xì)胞裂解的操作步驟,，應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行,。

7、為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

有效期：12個(gè)月有效。