線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義

線粒體復(fù)合體Ⅲ（EC 1.10.2.2）又稱 CoQ-細(xì)胞色素 C 還原酶，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,，負(fù)責(zé)把還原型 CoQ 的氫傳遞給細(xì)胞色素 C,，生成還原型細(xì)胞色素 C。

測定原理

與氧化型細(xì)胞色素 C 不同,，還原型細(xì)胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收,，因此 550nm 光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計,、臺式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存,；

試劑四：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存,；

試劑六：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞,，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2,、 將勻漿 600g,，4℃離心 5min。

3,、 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心 10min,。

4,、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ（此步可選

做）,。

5,、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測定,。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 550nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液,，立即混勻,，記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1,。

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個酶活力單位,。

?   此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ （ε×d ）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)

÷T=124×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.248×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10^-4 L,；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL； W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬,。

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