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乳,、乳制品及飼料中三聚氰胺的測定
乳、乳制品及飼料中三聚氰胺的測定
一．名詞簡介
1. 三聚氰胺理化性質(zhì)
三聚氰胺：英文名“melamine”,，簡稱三胺,，學名三氨三嗪，別名蜜胺,、氰尿酰胺,、三聚酰胺。分子式：C3N6H6,、C3N3(NH2)3,；分子量：126.12；物理性能：白色結(jié)晶粉末,，無毒,，無味；相對密度：1570kg/m³,；熔點：在常壓下,，354℃分解；升華溫度：300℃,；溶解性：能溶于甲醇,、甲醛、乙酸,、熱乙二醇,、甘油、吡啶,；微溶于水,、乙醇；不溶于乙醚,、苯和四氯化碳,，水溶液呈弱堿性。
化學性能：三聚氰胺是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料,，顯弱堿性,，能夠與各種酸反應生成三聚氰胺鹽,；在強酸或強堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解,，胺基逐步被羥基取代,，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸,；三聚氰胺與醛類反應生成加成化合物,；三聚氰胺與甲醛反應制成樹脂，三聚氰胺樹脂是一種多種用途的材料,，防火耐熱且有很高的穩(wěn)定性,，用于生產(chǎn)塑料、地板磚,，廚房用具,，防火纖維,，商業(yè)濾膜,，膠水和阻燃劑。
2. 乳制品
是指以生鮮牛（羊）乳及其制品為主要原料,，經(jīng)加工而制成的各種食品,。本標準所指的乳制品包括液體乳類（殺菌乳、滅菌乳,、酸牛乳,、配方乳）、乳粉類（全脂乳粉,、脫脂乳粉,、全脂加糖乳粉和調(diào)味乳粉、嬰幼兒乳粉,、其他配方乳粉）,、含乳飲料類、煉乳類（全脂無糖煉乳,、全脂加糖煉乳,、調(diào)味煉乳；配方煉乳）,、乳脂肪類（稀奶油,、奶油、無水奶油）,、干酪類（原干酪,；再制干酪）、乳冰淇淋類（乳冰淇淋,、乳冰）和其他乳制品類（干酪素,、乳糖,、乳清粉、濃縮乳清蛋白）等,。
1. 原理
試樣經(jīng)溶解,、超聲提取、沉淀蛋白,、過濾得到測試液,，經(jīng)液相色譜測定，根據(jù)保留時間和紫外吸收光譜定性,，根據(jù)峰面積進行定量,。
2 試劑
方法中所用試劑，除另有規(guī)定外,，均為分析純試劑,，水為GB/T 6682-2008中一級用水，溶液為水溶液,。
2.1 磺基水楊酸,。
2.2 檸檬酸。
2.3 辛烷磺酸鈉：液相色譜離子對試劑,。
2.4 乙腈：色譜純,。
2.5 鹽酸。
2.6 60 g/L磺基水楊酸：稱取60 g磺基水楊酸用水定容至1 L,。
2.7 0.1 mol/L鹽酸：量取8.3 mL鹽酸用水稀釋至1 L,。
2.8 緩沖液：檸檬酸和辛烷磺酸鈉濃度均為10 mmol/L。
2.9 三聚氰胺標準品：已知含量大于99%,。
2.10 標準儲備液：稱取三聚氰胺標準品0.01g（準確至0.0 001g）,，用甲醇配制成濃度為1mg/mL標準儲備液。
2.11 標準系列：將標準儲備液用0.1 mol/L鹽酸逐級稀釋至0.25µg/mL,，0.50µg/mL,，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL,，4.00 µg/mL,，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL的系列標準溶液,。
3 儀器成套性
3.1 液相色譜儀
3.1.1 P3000型 高壓輸液泵
3.1.2 UV3000紫外檢測器
3.1.3 Rehodyne手動進樣閥(20μl)
3.1.4 CXTH3000色譜工作軟件
3.1.5 ODS（VenusilASB-C18色譜柱） 250 mm×4.6 mm,，5 µm
3.1.6 分析啟動工具包
3.1.7 溶劑托盤
3.1.8 試劑包
3.1.9 保護柱和柱芯
3.1.10真空固相萃取裝置（含混合型的陽離子交換柱10根）
3.2 溶劑過濾器（含真空泵）
3.3 超聲波清洗器
3.4 柱溫箱
3.5 高速離心機：轉(zhuǎn)速>4 000 r/min
3.6 旋渦混勻器
3.7 分析天平：感量0.1mg
4 樣品處理
4.1 固態(tài)乳制品
稱取1.0 g左右試樣（準確至0.0 001 g），加入0.1 mol/L 鹽酸約15 mL,，渦旋混勻,，超聲提取30 min后加入60 g/L磺基水楊酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL，混勻后離心,，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過濾后進樣,。
4.2 液態(tài)乳制品（包含酸奶）
稱取15 g左右試樣（準確至0.0 001 g），加入60 g/L磺基水楊酸3 mL~4 mL,，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL,，混勻后離心，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過濾后進樣,。
4.3 飼料
稱取1.0g左右試樣（準確至0.0 001 g）,，將樣品用研缽充分碾碎混勻，加入0.1 mol/L 鹽酸約15 mL,，渦旋混勻,，超聲提取30 min后加入60 g/L磺基水楊酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL,，混勻后離心,，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過濾后進樣。
5 測定步驟
5.1 色譜條件
5.1.1 色譜柱：ODS或C8,，250 mm×4.6 mm,，5 µm。
5.1.2 流動相：緩沖液︰乙腈=85︰15,。
5.1.3 流速：1.0 mL/min,。
5.1.4 柱溫：40 ℃,。
5.1.5 波長：240 nm,。
上述色譜條件是典型的，可根據(jù)實際情況做具體調(diào)整,。如果分離效果不理想,，將水相改為：檸檬酸和辛烷磺酸鈉濃度均為10 mmol/L，加3mL三氯乙酸,，配制成1000mL溶液,，流動相用氨水調(diào)PH值3.9到3.95。
5.2 測定
5.2.1 標準曲線制備
將標準系列0.25µg/mL,，0.50µg/mL,，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL,，4.00 µg/mL,，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL分別進樣20 µL,以峰面積為縱坐標,，濃度為橫坐標作圖,，制作標準曲線。
5.2.2 樣品測定
取制備好的試樣溶液進樣20 µL,進行液相色譜分析。根據(jù)保留時間和紫外吸收光譜定性,，根據(jù)峰面積進行定量,。三聚氰胺的標準樣品色譜圖見圖1，液態(tài)奶樣品色譜圖見圖2,，奶粉樣品色譜圖見圖3,。
圖1 標樣色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流動相：緩沖液︰乙腈=85︰15,，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長：240 nm
圖2 液態(tài)奶樣品色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm,，5μm
流動相：緩沖液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長：240 nm
圖3 奶粉樣品色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm,，5μm
流動相：緩沖液︰乙腈=85︰15,，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長：240 nm
6 結(jié)果計算
6.1 計算
試樣中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）計算:
C×V
X = ————………………………………………………（1）
m
式中：X—樣品中三聚氰胺含量，mg/kg,；
C—從標準曲線上查出的含量,，µg/mL；
V—定容體積,，mL,；
m—稱樣量，g,。
平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示,，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
本文參考以下方法：
HPLC-UV檢測方法
三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差,，需要用離子對試劑色譜方法才能有良好的保留與分離,，按照美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測方法和中國農(nóng)業(yè)部頒部的三聚氰胺檢測方法，采用北京創(chuàng)新通恒科技有限公司的ODS,，Ｃ１８色譜柱,，能夠得到良好的結(jié)果。
1,、 三聚氰胺的FDA檢測方法
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS 4.6×250mm
緩沖液：10mM檸檬酸,，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0,。
流動相：緩沖液：乙腈=85：15
進樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,，進10μL，
進樣前用0.22μm針式過濾器過濾
流 速：1.0mL/min
柱 溫：40 ℃
波 長：240nm
2,、三聚氰胺的中國農(nóng)業(yè)部頒標準檢測方法
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS 4.6×250mm
緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉
流動相：緩沖溶液:乙腈=85:15
進樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,，進10uL
進樣前用0.22μm針式過濾器過濾
流 速：1.0mL/min
柱 溫：40℃
波 長：240nm
山東金普分析儀器有限公司 技術(shù)部