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細(xì)胞劃痕(wound healing）法是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和修復(fù)能力的方法。
一、原理
在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上,，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線,，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間,，取出細(xì)胞培養(yǎng)板,，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力。
通過不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同,，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力的差別,。
二、步驟
1,、準(zhǔn)備：
所有能滅菌的器械都要滅菌,，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min（超凈臺(tái)內(nèi)）
2、流程：
1. 培養(yǎng)板劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后,，用直尺比著,，均勻得劃?rùn)M線，大約每隔 0.5~1 cm 一道,，橫穿過孔,，每孔至少穿過 5 條線；
2. 鋪細(xì)胞：在孔中加入約 5×105 個(gè)細(xì)胞,，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同,，掌握為過夜能鋪滿；
3. 細(xì)胞劃線：第二天用槍頭比著直尺,，盡量垂至于背后的橫線劃痕,，槍頭要垂直，不能傾斜,；
4. 洗細(xì)胞：用 PBS 洗細(xì)胞 3 次,，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基,；
5. 細(xì)胞培養(yǎng)及觀察：放入 37℃,、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng),；按 0,，6，12,，24 小時(shí)取樣,，倒置顯微鏡觀察特定位置細(xì)胞遷移情況并拍照；
6. 結(jié)果分析：使用 Image J 軟件打開圖片后,，隨機(jī)劃取 6-8 條水平線,，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。
三、注意事項(xiàng)
1,、鋪細(xì)胞最好使用 6 孔板,，因?yàn)?6 孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因?yàn)橛?5 條定位線,，與劃痕相交,，這樣就有10 個(gè)可固定監(jiān)測(cè)點(diǎn)，不作重復(fù),，誤差也很小,。
2、如果你連續(xù)監(jiān)測(cè) 24 小時(shí),，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果,，而不是單純的細(xì)胞遷移。
如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移,，你可以先用（1 ug/ml）處理一小時(shí),，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了,。另外,，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
3,、照片拍完之后,，可以用 ImageJ 來測(cè)量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。
4,、雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響,，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多,。
5、應(yīng)盡量清洗掉散落的細(xì)胞,，對(duì)于一些細(xì)胞,，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數(shù)據(jù)美觀,。
四,、常見問題
1.劃痕法測(cè)量適用的細(xì)胞范圍較小，一般只適用于上皮細(xì)胞,，纖維樣細(xì)胞,。
2.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié),，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多,。
3、在用 PBS 緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入,，以免沖散單層貼壁細(xì)胞,，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。
4,、一般做劃痕實(shí)驗(yàn),，需要排除細(xì)胞增殖的影響，一般在不影響細(xì)胞增殖的情況下采用低血清（<2%）或者無血清,，否則細(xì)胞增殖就不能忽略,，這樣對(duì)于遷移較慢的細(xì)胞就需要延長(zhǎng)拍攝時(shí)間（也可用絲裂酶處理一小時(shí)）。
5,、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕,，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn),，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題,。
6、每次拍照前,、后,，盡量換掉培養(yǎng)基，去除飄落的細(xì)胞,，能得到較為干凈的劃痕區(qū)域,。