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　　【步驟】(以間接免疫熒光法為例)
 

　　1  細胞準備與固定
 

　　(1)單層生長細胞：取對數(shù)生長細胞,，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液,。將細胞接種到預(yù)先放置幾張6×22mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-3天,，待細胞接近長成單層,，取出蓋玻片，進入PBS(0.01 mol/L,pH7.4)洗2次,，然后根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇適當(dāng)固定劑固定細胞。常用固定劑有：95%乙醇(固定時間10-30min),，丙酮(5-10min)等,。
 

　　(2) 懸浮生長細胞：取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌(1000rpm，5min)2次,，或用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,，把細胞片浸入95%乙醇或丙酮中固定。
 

　　2  將已經(jīng)固定的細胞玻片放入蓋片染色缸,，用PBS振洗5min,，取出吹干。
 

　　3  滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體,，置于濕盒內(nèi),，37度保溫30-60min或度冰箱過夜。
 

　　4  PBS振洗3次,，每次5min,，吹干。
 

　　5  滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標記抗體,，置于濕盒內(nèi),，37度保溫30-60min。
 

　　6  PBS振洗2次,，每次5min,，然后用蒸餾水振洗1次。
 

　　7  50%緩沖甘油封片,。
 

　　【結(jié)果】
 

　　在熒光顯微鏡下觀察,，陽性部位出現(xiàn)熒光，依熒光素種類不同呈現(xiàn)不同顏色的熒光,，入FITC呈現(xiàn)黃綠色熒光,，羅丹明B200呈現(xiàn)橙紅色熒光。
 

　　標本染色反應(yīng)后應(yīng)及時觀察并照相,。若無時間立即觀察標本,，可把標本放入4度冰箱保存。但應(yīng)注意,，過夜后特異性熒光減弱30%,，一周后則減弱50%。如果用聚乙烯醇封片,，可保存較長時間,。