一,、 目的
使用恒溫培養(yǎng)箱,、恒溫水浴鍋、了解細(xì)胞分裂素對(duì)離體子葉的保綠作用及基本原理和方法,。
二,、原理 細(xì)胞分裂素可阻礙核酸水解酶和蛋白水解酶的產(chǎn)生,因此能延緩器官衰老,,使離體葉片保綠,,保綠作用的強(qiáng)弱可通過測(cè)定葉綠素含量的變化來衡量,也可由葉色變黃枯死的時(shí)間來衡量,。
三,、材料、儀器設(shè)備及試劑
1. 材料:黃瓜子葉,;蘿卜子葉,。
2. 儀器設(shè)備:電子分析天平;分光光度計(jì),;恒溫培養(yǎng)箱,;恒溫水浴鍋;25ml容量瓶,;25ml刻度試管,;試管架;移液管,;黃瓜子葉的培養(yǎng)皿(直徑5cm),;瓷盤;刀片,;尖頭鑷子,;濾紙;吸耳球等,。
3. 試劑及配制:100μg·ml-16-BA溶液,;95﹪乙醇 ;CaCO3粉末,。 100μg·ml-16-BA母液配制:準(zhǔn)確稱取6-BA 10mg, 加幾滴1mol·L-1HC1溶解(可稍加熱溶解),,然后慢慢加入蒸餾水稀釋后定容至100ml。
四,、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 黃瓜幼苗的培養(yǎng) 精選黃瓜種子,,播入墊有濾紙的瓷盤中,加蒸餾水使之濕潤(注意種子不能漬水),,待種子萌發(fā)后,,在光下培養(yǎng)2~3d左右,直至子葉綠化,。備用,。
2. 系列濃度6-BA溶液配制:吸取100μg·ml-16-BA母液,,稀釋成10、5,、0.5 μg·ml-1的系列濃度溶液,。
3. 離體黃瓜子葉的培養(yǎng)
(1)取4套培養(yǎng)皿,編號(hào),,每套培養(yǎng)皿各墊一張濾紙,,分別作0.5、5,、10μg·ml-1的6-BA溶液和蒸餾水(CK)4個(gè)處理,,即為組。
(2)選取子葉大小,、生長(zhǎng)一致的黃瓜幼苗20株,,每處理5 株(10片子葉),用刀片切下不附帶葉柄的子葉,,分別稱取鮮重,,將數(shù)據(jù)記入下表中。然后將子葉放入組相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中,,分別加入不同濃度的6-BA溶液3ml, 對(duì)照(CK)加蒸餾水3ml,。蓋上培養(yǎng)皿蓋,置于暗處,,溫度25-28℃培養(yǎng)3 d ,。 另取與組相同的黃瓜幼苗20株,用刀片切下不附帶葉柄的子葉作第二組,,直接用來測(cè)定葉綠素含量,。
4. 第二組黃瓜子葉葉綠素含量的測(cè)定
(1)葉綠素的提取 取3支25ml刻度試管,編號(hào),。稱取第二組的黃瓜子葉三份(3個(gè)重復(fù)),,每份10片子葉,然后放入相應(yīng)編號(hào)的刻度試管中,,各加入少量CaCO3粉及95﹪乙醇3-4ml,,用玻棒小心將子葉搗碎后,將試管放入45℃恒溫水浴提取葉綠素30min左右,,直到子葉碎片無色為止,,用濾紙過濾于25ml容量瓶中(如殘?jiān)詭ЬG色,可再加幾ml乙醇繼續(xù)提取,,直至殘?jiān)鼰o綠色),。濾紙上的色素用乙醇慢慢點(diǎn)滴清洗入容量瓶中,后定容至刻度,搖勻,,待測(cè)。
(2)葉綠素含量的測(cè)定 在652nm波長(zhǎng)處,,以95﹪乙 醇為空白對(duì)照,,測(cè)定葉綠素提取液的吸光度(A值)。并按公式計(jì)算出葉綠素含量,。即為培養(yǎng)前子葉的原始葉綠素含量,。
5. 組黃瓜子葉葉綠素殘留量的測(cè)定 組黃瓜子葉在暗處培養(yǎng)3d后,按上述第(4)步驟方法分別測(cè)定各處理子葉葉綠素含量,,并按公式計(jì)算出各處理葉綠素含量,,即為暗培養(yǎng)后子葉葉綠素含量。
五,、結(jié)果計(jì)算 葉綠素含量計(jì)算公式:
D652 × 提取液總量(ml) 葉綠素含量(mg·g-1Fw)= —————————————— 34.5 × 樣品鮮重(g) 公式中:D652 — 在652nm波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度值 34.5— 葉綠素a,、b在652nm波長(zhǎng)處的比吸收系數(shù) 培養(yǎng)后葉綠素含量 暗培養(yǎng)后葉綠素含量占培養(yǎng)前葉綠素含量(﹪)= —————————×100 培養(yǎng)前葉綠素含量
六、恒溫培養(yǎng)箱,、恒溫水浴鍋,、詳情可咨詢喆圖小編。
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