仙人掌肉質(zhì)莖中含有多種生物堿, 其中主要為酪胺,、N- 甲基酪胺,、3- 甲氧基酪胺、β- 苯乙胺,、大麥芽堿等酪胺更是仙人掌中生物堿的重要成分,。接下來給大家介紹用CO?培養(yǎng)箱從仙人掌里面提取生物堿時(shí)所需設(shè)備及實(shí)驗(yàn)方法如下：
實(shí)驗(yàn)對象：HL-60細(xì)胞
提取實(shí)驗(yàn)所需儀器：熒光倒置顯微鏡、凈化工作臺,、1640培養(yǎng)基,、高速冷凍式離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)室超純水器、立式壓力蒸汽滅菌器,、酶標(biāo)儀,、離心沉淀器、遠(yuǎn)紅外干燥箱,、恒溫加熱磁力攪拌器,、轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱恒溫水浴鍋,、循環(huán)水式真空泵,、紫外分光光度計(jì)、電熱套,、圓底燒瓶,、蛇形冷凝管、布氏漏斗,、分液漏斗,、分析天平、容量瓶,、量筒,、燒杯、膠頭滴管,、移液管,、比色管。
實(shí)驗(yàn)試劑：Sigmo MTT試劑,、臺盼藍(lán)染液,、1640培養(yǎng)液、乙醇,、甲醇,、1 mol / L的硫酸,、濃氨水,、改良碘化鉍鉀試劑,、酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、KB r粉末,。
方法
1,、仙人掌中生物堿的提取分離與精制將仙人掌粉碎，取細(xì)粉20g,，在條件為：乙醇濃度95 % ,、物料比1∶15 、提取溫度50 ℃,、提取時(shí)間3 h的條件下，乘熱抽濾，濾渣再于同一條件下提取2h,，乘熱抽濾,，合并濾液，濾液減壓于水浴鍋中濃縮,，再將濾液放冷析出結(jié)晶,，得粗提物。向粗提物中加入適量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 濾去酸水液中的沉淀, 加入適量的濃氨水調(diào)至pH 值9 ～10 ,。然后用分液漏斗萃取3-4h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后抽濾,，得總生物堿。
2,、仙人掌中生物堿類物質(zhì)的鑒定
化學(xué)法檢查：將提取的總生物堿液,，用1%的鹽酸萃取，得鹽酸溶液10毫升,，分為四個小試管儲存,，分別在四個小試管中加入改良碘化鉍鉀、碘-碘化鉀,、硅鎢酸試劑,，觀察各試管中的變化。
薄層層析檢查：取總生物堿少許—丙酮—甲醇（6∶1∶1）溶解, 用毛細(xì)管點(diǎn)樣于預(yù)先制備好的硅膠GF254 板上, 上行法展開,。當(dāng)展開劑跑至硅膠板前沿約1～2cm 處時(shí), 取出, 揮干溶劑,。先觀察熒光, 后用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色,觀察斑點(diǎn)位置及顏色，同時(shí)用酪胺標(biāo)準(zhǔn)品作對照,。
3,、白血病
HL-60細(xì)胞培養(yǎng)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加青霉素100μg·mL-1,，鏈霉素100μg·mL-1,，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃飽和培養(yǎng),。
4 ,、總生物堿的抑瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作把總生物堿提取物用牛皮紙封好口，離心管與培養(yǎng)瓶放在鋁制盒里,，和替補(bǔ)頭一起在壓力蒸汽滅菌器里滅菌,，20分鐘后放入遠(yuǎn)紅外干燥箱干燥后備用。
5,、接種細(xì)胞
取對數(shù)期生長的HL-60細(xì)胞,，用離心機(jī)1000rmp離心10min后，小心棄去上清液,，分別與0.25%胰蛋白酶消化液,、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105 個/ml的單細(xì)胞混懸液,，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱中,，37℃的培養(yǎng)過夜,，備用。
6,、加藥培養(yǎng)
將提取物制備成10個不同濃度劑量,，分別為：5，10,，20,，50，100,，200,，400，600,，800,1000ug/ml,。
7、再將不同濃度的提取物
50ul分別加入各接種了HL-60細(xì)胞的試驗(yàn)孔中,，平行5孔
8,、設(shè)置只加細(xì)胞，
不加藥液的對照孔和只加培養(yǎng)液的空白孔,均平行5孔,，繼續(xù)培養(yǎng)24,、48、72h
9,、熒光倒置顯微鏡觀察法測定
在加藥培養(yǎng)前和加藥培養(yǎng)后的24,、48、72h于熒光倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組與空白組不同時(shí)期細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài),。
10,、MTT法檢測
取處于指數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，用離心機(jī)1000rmp離心10min后,，小心棄去上清液,，分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104個/ml的單細(xì)胞混懸液,，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中,，并設(shè)空白對照孔，只加培養(yǎng)液,，不加細(xì)胞,，置5% CO2，37℃的CO2培養(yǎng)箱中過夜,。
11,、換液,，加入受試藥物，50μl/ 孔,，每個濃度設(shè)5 個重復(fù),，細(xì)胞在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 8 h 后，加入MTT20μl/ 孔(5mg/ml),，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中、置5% CO2 反應(yīng)4h,。
12,、小心吸去上清液，加入DMSO 溶解,，每孔150μl,平板搖床上振搖5min,。用酶標(biāo)儀在波長為570nm 處測定每孔的OD值，測時(shí)須減去空白對照,，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,。
13、計(jì)算細(xì)胞存活率及藥物對細(xì)胞的抑制率,。
細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100% 細(xì)胞抑制率(%)= （1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%
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