今天喆圖小編就來說說樹舌靈芝又稱樹舌扁靈芝，屬于真菌門,、擔子菌亞門,、層菌綱、非菌褶目,、靈芝菌科,、靈芝屬。樹舌具有廣泛的藥理活性,，民間用其治療食道癌,、肺結核，臨床用于治療腹水癌,、神經(jīng)系統(tǒng)疾病,、肝炎、心臟病,、糖尿病和糖尿病并發(fā)癥,，預防和治療胃潰瘍,、急慢性胃炎、十二指腸潰瘍,、胃酸過多等胃病。另外研究表明,，樹舌三萜類物質具有血壓雙向調節(jié),、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性,。目前國內對樹舌靈芝的化學成分和藥理學研究得比較多,，但對樹舌靈芝深層發(fā)酵方面的研究較少。深層發(fā)酵培養(yǎng)樹舌菌絲體具有發(fā)酵周期短,、工藝簡單,、易控制、適于工業(yè)化大生產(chǎn)等優(yōu)點,。本試驗應用高氯酸——香草醛顯色法來測定樹舌靈芝發(fā)酵菌絲總三萜類化合物含量,，以總三萜產(chǎn)量為基準，篩選出樹舌靈芝深層發(fā)酵的適培養(yǎng)基,。
通過單因素試驗,，確定樹舌靈芝的適宜氮源為豆餅粉，適宜碳源為米糠和蔗糖,；在此基礎上,，以篩選的碳源、氮源和無機鹽KH2PO4 和MgSO4·7H2O為考察因素,，以總三萜產(chǎn)量為主要指標利用正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基配方比例,，確定樹舌靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：米糠4%、蔗糖1%,、豆餅粉4%,、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%,。
一,、 （材料和儀器 ）
1、實驗所需材料 硝酸銨,、硫酸銨,、氯化銨、硝酸鉀,、蛋白胨,、酵母膏、葡萄糖,、蔗糖,、可溶性淀粉,、磷酸氫二鉀、硫酸鎂,、高氯酸,、冰醋酸、香草醛均為分析純,；齊墩果酸對照品,，中國藥品生物制品檢定所；豆餅粉,、玉米粉,、麥芽粉、甘薯粉,、米糠和麩皮均為提取液,，煮沸0.5h后用紗布過濾制得。
2,、實驗用主要儀器設備
鼓風干燥箱,，立式高壓滅菌鍋，電子天平,，紫外分光光度計,，恒溫水浴鍋，恒溫搖床,，恒溫培養(yǎng)箱,。
二、（實驗方法 ：基本培養(yǎng)基）
1.1 斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基為土豆20%,，葡萄糖2%,，瓊脂2%，pH自然,。接一塊綠豆粒菌塊接種于PDA培養(yǎng)基的中央,，放入恒溫培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)7天。
1.2 液體培養(yǎng)基 玉米粉1%,，蔗糖2%,，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%,，MgSO4·7H2O 0.05%,，pH自然。
1.3 氮源篩選培養(yǎng)基 葡萄糖2%,，可溶性淀粉1%,，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%,，PH自然,。分別以豆餅粉,、麩皮、蛋白胨,、酵母膏,、硫酸銨、硝酸銨,、氯化銨,、硝酸鉀為氮源，添加量為2%,。
1.4 碳源篩選培養(yǎng)基 麩皮2%，KH2PO4 0.1%,，MgSO4·7H2O 0.05%,，pH自然。分別以葡萄糖,、蔗糖,、可溶性淀粉、玉米粉,、麥芽粉,、甘薯粉、米糠等為碳源,，添加量為3%,。
培養(yǎng)方法
2.1 種子液制備 將斜面菌種分割成黃豆大小，接種到液體培養(yǎng)基中,，250mL三角瓶裝液量100mL,，于恒溫搖床中25℃，120r/min振蕩培養(yǎng)10d得一級種,。將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種以體積分數(shù)10%接種到同樣液體培養(yǎng)基中,，500mL三角瓶裝液量200mL，在與一級種同樣條件下培養(yǎng)7d得種子液備用,。
2.2 培養(yǎng)基篩選 將制備好的種子液按體積分數(shù)10%接種量接種到不同的碳氮源培養(yǎng)基及正交試驗篩選培養(yǎng)基中,，250mL三角瓶裝液量100mL，于恒溫搖床中25℃,，120r/min振蕩培養(yǎng)7d后收集菌絲體,。分析不同碳源、氮源對菌絲體生物量和三萜總量的影響,。每次試驗重復3次,，結果取平均值。
2.3 混合碳氮源培養(yǎng)基正交試驗 根據(jù)單因素試驗篩選結果,，并考慮到低投入高產(chǎn)出的原則,，選用米糠和蔗糖作為復合碳源,，豆餅粉作為氮源，磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為無機鹽,，按L9（34）設計四因素三水平試驗,，9個組合，4次重復,，優(yōu)化培養(yǎng)基,。
2.4 發(fā)酵菌絲體生物量測定 采用細胞干重法，取100ml發(fā)酵液,，用100目紗網(wǎng)過濾得菌絲體,，并用蒸餾水反復沖洗，至濾出液澄清為止,，收集菌絲體,，于60℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，稱重,。
三,、（三萜含量測定）
3.1 標準溶液的制備（200μg/ml齊墩果酸） 稱取干燥至恒重的齊墩果酸20mg，置于100ml的容量瓶中加無水乙醇溶解,，并定容至刻度,，作為對照品溶液。
3.2 樣品溶液的制備 取樣品0.5g（到萬分之一）,，加入10ml無水乙醇,，超聲波提取30min后，搖勻,，過濾,，取濾液，定容至50mL,，即得樣品溶液,。用分光光度法測定樣品中靈芝三萜物質含量。
3.3 標準曲線的制作 精密吸取齊墩果酸標準溶液0.2,、0.4,、0.6、0.8,、1.0,、1.2mL, 于6只具塞磨口試管中。加5%香草醛-冰醋酸液0.4mL,，搖勻,。再加入0.6mL高氯酸，置于60℃恒溫水浴鍋中20 min，冰浴冷卻后,，加冰醋酸5.0 mL,，搖勻，置于室溫15 min后,，按分光光度法（《中國藥典》2005版 I部附錄VA）,，以試劑為空白，在545nm處比色測定吸光度值,。以齊墩果酸濃度（?g/ml） 為橫坐標,，吸光度A為縱坐標，作圖得標準曲線,。
3.4 樣品的測定 吸取1ml樣品溶液,，按標準曲線方法測定吸光度。用標準曲線法計算樣品中總三萜酸提取物質量,。
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