人們采取無菌操作的方法,，把某種食用菌從混雜的微生物中,，單獨地分離開來，這個過程叫做菌種分離,。從分離過程中得到的菌絲體純化后,，就是純菌種。在實驗室條件下,，以人工使純菌種大量生長和繁殖的方法,，叫做培養(yǎng)。下面由小編帶大家了解一下,，如何培養(yǎng)菌種,。
1.1材料
1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌。
1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g,，酵母膏5g,，NaCl10g，蒸餾水1000ml,，pH為7,，（可溶性淀粉20g）瓊脂20g。
（2）篩選用培養(yǎng)基：含有2%可溶性淀粉的LB培養(yǎng)基,。
（3）種子培養(yǎng)基：豆餅粉4%,，玉米粉3%，Na2HPO40.8%,，(NH4)2SO40.4%,，NH4Cl0.15%，H2O,。
（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉5.6%,，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%,，(NH4)2SO40.4%,， NH4Cl0.13%，CaCl20.13%,，α—淀粉酶50g,。
【2】 1.1.3 主要試劑
蔗糖、葡萄糖,、淀粉,、玉米淀粉、麥芽糖,、酵母浸出物,、胰蛋白胨,、(Beef Extract）、尿素,、氯化銨,、硫酸錳、硫酸鎂,、磷酸二氫鈉,、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵,、氯化鈉和氯化鈣,。
1.1.4 儀器設備
控溫搖床、高壓蒸氣滅菌鍋,、電子天平,、pH測定儀,、無菌操作臺和紫外分光光度計,。
1.2方法
1.2.1 培養(yǎng)基的制備
(1)稱量
按培養(yǎng)基配比依次準確地稱取酵母膏、NaCl,、蛋白胨放入燒杯中,，并在燒杯中加入少量蒸餾水。注：酵母膏常用玻棒挑取,，放在小燒杯或表面皿中稱量,，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱量紙上,，稱量后直接放入水中,，這時如稍微加熱，酵母膏便會與稱量紙分離,，然后立即取出紙片,。
(2)溶化
可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數(shù)的可溶性淀粉放入一個小燒杯中，加入少量蒸餾水,，攪拌成糊狀,，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養(yǎng)基總體積的沸水中，一邊攪拌一邊加熱,，待其溶化成透明狀后繼續(xù)在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液,。 如果配制固體培養(yǎng)基時，將已準備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中,，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中,，再加熱溶化，補水到所需的總體積,。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時,，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中,，然后按2%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化,，而是滅菌和加熱溶化同步進行,，節(jié)省時間。 在瓊脂溶化過程中,，應控制火力,，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時,，需不斷攪拌,，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時,，不能用銅或鐵鍋加熱溶化,，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長,。
(3)調pH 培養(yǎng)基配好以后,，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸,，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加1mol/LNaOH,，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH,，直到pH達7為止,；反之，用1mol/LHCl進行調節(jié),。 對于有些要求pH較精細的微生物,，其pH的調節(jié)可用酸度計進行。 注意：pH不要調過頭,，以避免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度,，配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時，若預先調好pH并在高壓蒸汽下滅菌,，則瓊脂因水解不能凝固,，因此應將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌,，再調整pH,。
(4)分裝 按照實驗要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內或三角瓶中,。 液體分裝：分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜,；分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶的一半為宜,。 固體分裝：分裝于試管中的應不超過試管的1/5,，滅菌后制成斜面,；分裝三角瓶的量以不超過一半為宜。
(5)加塞 培養(yǎng)基分裝完畢后,，在試管口上塞上棉塞,，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能,。
(6)包扎 加塞后,，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙,，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞,，外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱,，組別,，配制日期。三角瓶加塞后,，外包牛皮紙,，用麻繩以活結扎好，使用時容易解開,，同樣注明,。
(7)滅菌 將配置好且包扎完畢的固體,、液體培養(yǎng)基及本實驗涉及的試管,、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa，121℃條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘,。
(8)斜面擱置 將培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時放置斜面,，斜面在試管的1/2處為宜，待斜面凝固后,，放置于冰箱中待用,。
1.2.2菌種的篩選與保藏
(1)倒平板 將實驗配制好的培養(yǎng)基加熱溶化，待冷卻至55—60℃時,，倒平板9皿,。
(2)稀釋 用接種環(huán)取菌種，放入盛90ml無菌水的三角瓶中,，振搖,。用一支1ml無菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中,，混合均勻,，以此類推制成10-1、10-2,、10-3,、10-4,、10-5、10-6不同稀釋度的菌液,。
(3)劃線 將平板底面分別用記號筆寫上10-4,、10-5、10-6三種稀釋度（共三組）然后用接種環(huán)分別沾取濃度為10-4,、10-5,、10-6稀釋液并對號在相應平板上劃線，室溫下靜止5—10min,，使菌液吸附進培養(yǎng)基,。
(4)培養(yǎng) 將培養(yǎng)基平板倒置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2—3天,，觀察淀粉圈,。對有淀粉圈的菌落，測量淀粉圈的直徑D,，菌落直徑r,，計算D/r的比值，可進行拍照,，選擇淀粉圈較大的菌落作為后續(xù)實驗的菌種,。
(5)接種 接種到斜面培養(yǎng)基中，標注上日期等信息,。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為一級種子,。
(6)保藏 斜面置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2—3天,，觀察菌種長勢好壞,，若菌種長勢好則將其放入冰箱中保藏，若長勢不好則需多次斜面轉接,。
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