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CRISPR/Cas9技術(shù)問世以來,，迅速成為生物科學(xué)領(lǐng)域的游戲規(guī)則改變者,，7月31日，個(gè)成功將CRISPR/Cas9搜索功能用于實(shí)踐的生物技術(shù)初創(chuàng)公司-Mammoth Biosciences贏得了2300萬美元融資,，更是讓CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)入烈火油烹的境界,。然而，該技術(shù)導(dǎo)致雙鏈DNA的斷裂,，一度成為阻礙CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的絆腳石,。近日，學(xué)術(shù)期刊《Nature Genetics》發(fā)表的一篇文章表示科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9的第三條作用途徑！而且這條途徑中還存在可以修復(fù)斷裂的DNA雙鏈的關(guān)鍵蛋白,！這對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要,！

在談新途徑前，得先說說CRISPR/Cas9的“舊途徑”是什么,。簡(jiǎn)單點(diǎn)說,，CRISPR/Cas9就是對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割和再修復(fù)，而所謂的“舊途徑”就是指DNA再修復(fù)的兩條常見途徑,。

在DNA鏈斷裂后,，CRISPR/Cas9有兩個(gè)選擇，要么直接添加堿基,，破壞原有基因功能,，通過沉默基因?qū)崿F(xiàn)基因敲除，要么利用單鏈DNA模板,，引入新的序列,，對(duì)基因進(jìn)行編輯。

這就是所謂的“非同源性末端接合（NHEJ）”與“同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）”,。這兩種途徑存在很大的問題-一些DNA斷裂后無法或難以及時(shí)修復(fù),，這也是日益喧囂的“CRISPR/Cas9安全問題”的緣由之一。

那么,，為什么NHEJ和HDR無法*修復(fù)所有切割后的DNA鏈呢,？這就要怪CRISPR/Cas9系統(tǒng)的“動(dòng)態(tài)平衡”了。這就像一個(gè)可逆的化學(xué)方程,，當(dāng)基因編輯進(jìn)行一段時(shí)間后,，切割和修復(fù)過程就會(huì)自行達(dá)到平衡，這也是所謂的“飽和”問題,。

而平衡后,，尚有已斷裂的DNA無人修復(fù)，從而導(dǎo)致一些基因功能的缺失,。因此,，要解決DNA斷裂問題，就是要讓這個(gè)平衡方程向修復(fù)方向da程度傾斜,，而加州大學(xué)伯克利分校的研究人員們發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9新途徑-Fanconi貧血途徑就有此功能,。

FANCD2在Cas9切割的雙鏈斷裂位點(diǎn)富集

Fanconi貧血途徑涉及21種不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的任何相關(guān)基因受損,，都與一種罕見貧血癥-Fanconi貧血癥息息相關(guān),，這也是業(yè)內(nèi)對(duì)該途徑的普遍認(rèn)識(shí)。然而,，此次研究人員關(guān)注的是Fanconi貧血途徑與CRISPR/Cas9的關(guān)系,。

他們利用CRISPR干擾（CRISPRi）的技術(shù)對(duì)超過2000個(gè)基因進(jìn)行切割,，發(fā)現(xiàn)Fanconi貧血途徑中的FANCD2蛋白可長(zhǎng)期存在于CRISPR/Cas9產(chǎn)生的雙鏈斷裂位點(diǎn)上，調(diào)節(jié)FANCD2蛋白可以提高HDR頻率,。

也就是說,，FANCD2蛋白可以打破CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的切割-修復(fù)平衡，使平衡向修復(fù)方向傾斜,，提高基因編輯效率,，降低不良反應(yīng)。

Fanconi貧血途徑基因敲除影響HDR效率

Fanconi貧血途徑基因敲除不影響NHEJ效率

研究人員發(fā)現(xiàn),，F(xiàn)anconi貧血途徑并不作用于NHEJ，而是通過提高HDR效率將修復(fù)轉(zhuǎn)向單鏈模板修復(fù),。Fanconi貧血途徑與NHEJ是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,，只要Fanconi貧血途徑過度活躍，就會(huì)影響基因敲除的效率,。另一方面,，研究人員指出，F(xiàn)ANCD2蛋白對(duì)HDR效率的影響力度超乎想象,。

Fanconi貧血途徑在體內(nèi)普遍存在,，一旦Fanconi貧血途徑不夠活躍，F(xiàn)ANCD2蛋白功能受限,，HDR就處于報(bào)廢狀態(tài),！也就是說，無法引入新的序列,，無法基因進(jìn)行編輯,，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只能崩潰！所以,，如何把控Fanconi貧血途徑的活性,，是CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的重要課題！

Fanconi貧血途徑活性影響基因敲除和基因編輯

而且,，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)里,，F(xiàn)ANCD2蛋白能且只能在Cas9切開的位點(diǎn)積聚，那么它就可以作為Cas9切口的有效標(biāo)志,，這就可以幫助科學(xué)家們快速準(zhǔn)確地找出靶向和脫靶的切口,。

研究人員指出，這項(xiàng)研究有助于加深我們對(duì)CRISPR/Cas9機(jī)制的進(jìn)一步理解,，有望提高基因編輯的效率,，從而開發(fā)出更多有效的療法，為更多疾病帶來希望,。

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