首頁(yè) >> 公司動(dòng)態(tài) >> Nature：再也不怕DNA斷裂了！新途徑解決CRISPR效率問(wèn)題,！
CRISPR/Cas9技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，迅速成為生物科學(xué)領(lǐng)域的游戲規(guī)則改變者,，7月31日,，個(gè)成功將CRISPR/Cas9搜索功能用于實(shí)踐的生物技術(shù)初創(chuàng)公司-Mammoth Biosciences贏得了2300萬(wàn)美元融資，更是讓CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)入烈火油烹的境界。然而,，該技術(shù)導(dǎo)致雙鏈DNA的斷裂,，一度成為阻礙CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的絆腳石。近日,，學(xué)術(shù)期刊《Nature Genetics》發(fā)表的一篇文章表示科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9的第三條作用途徑,！而且這條途徑中還存在可以修復(fù)斷裂的DNA雙鏈的關(guān)鍵蛋白！這對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要,！
在談新途徑前,，得先說(shuō)說(shuō)CRISPR/Cas9的“舊途徑”是什么。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō),，CRISPR/Cas9就是對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割和再修復(fù),，而所謂的“舊途徑”就是指DNA再修復(fù)的兩條常見途徑。
在DNA鏈斷裂后,，CRISPR/Cas9有兩個(gè)選擇,，要么直接添加堿基，破壞原有基因功能,，通過(guò)沉默基因?qū)崿F(xiàn)基因敲除,，要么利用單鏈DNA模板，引入新的序列,，對(duì)基因進(jìn)行編輯,。
這就是所謂的“非同源性末端接合（NHEJ）”與“同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）”。這兩種途徑存在很大的問(wèn)題-一些DNA斷裂后無(wú)法或難以及時(shí)修復(fù),，這也是日益喧囂的“CRISPR/Cas9安全問(wèn)題”的緣由之一,。
那么，為什么NHEJ和HDR無(wú)法*修復(fù)所有切割后的DNA鏈呢,？這就要怪CRISPR/Cas9系統(tǒng)的“動(dòng)態(tài)平衡”了,。這就像一個(gè)可逆的化學(xué)方程，當(dāng)基因編輯進(jìn)行一段時(shí)間后,，切割和修復(fù)過(guò)程就會(huì)自行達(dá)到平衡,，這也是所謂的“飽和”問(wèn)題。
而平衡后,，尚有已斷裂的DNA無(wú)人修復(fù),，從而導(dǎo)致一些基因功能的缺失,。因此,，要解決DNA斷裂問(wèn)題，就是要讓這個(gè)平衡方程向修復(fù)方向da程度傾斜,，而加州大學(xué)伯克利分校的研究人員們發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9新途徑-Fanconi貧血途徑就有此功能,。
FANCD2在Cas9切割的雙鏈斷裂位點(diǎn)富集
Fanconi貧血途徑涉及21種不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的任何相關(guān)基因受損，都與一種罕見貧血癥-Fanconi貧血癥息息相關(guān),，這也是業(yè)內(nèi)對(duì)該途徑的普遍認(rèn)識(shí),。然而，此次研究人員關(guān)注的是Fanconi貧血途徑與CRISPR/Cas9的關(guān)系,。
他們利用CRISPR干擾（CRISPRi）的技術(shù)對(duì)超過(guò)2000個(gè)基因進(jìn)行切割,，發(fā)現(xiàn)Fanconi貧血途徑中的FANCD2蛋白可長(zhǎng)期存在于CRISPR/Cas9產(chǎn)生的雙鏈斷裂位點(diǎn)上，調(diào)節(jié)FANCD2蛋白可以提高HDR頻率,。
也就是說(shuō),，FANCD2蛋白可以打破CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的切割-修復(fù)平衡，使平衡向修復(fù)方向傾斜,，提高基因編輯效率,，降低不良反應(yīng)。
Fanconi貧血途徑基因敲除影響HDR效率
Fanconi貧血途徑基因敲除不影響NHEJ效率
研究人員發(fā)現(xiàn),，F(xiàn)anconi貧血途徑并不作用于NHEJ,，而是通過(guò)提高HDR效率將修復(fù)轉(zhuǎn)向單鏈模板修復(fù)。Fanconi貧血途徑與NHEJ是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,，只要Fanconi貧血途徑過(guò)度活躍,，就會(huì)影響基因敲除的效率。另一方面,，研究人員指出,，F(xiàn)ANCD2蛋白對(duì)HDR效率的影響力度超乎想象。
Fanconi貧血途徑在體內(nèi)普遍存在,，一旦Fanconi貧血途徑不夠活躍,，F(xiàn)ANCD2蛋白功能受限，HDR就處于報(bào)廢狀態(tài),！也就是說(shuō),，無(wú)法引入新的序列，無(wú)法基因進(jìn)行編輯,，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只能崩潰,！所以，如何把控Fanconi貧血途徑的活性,，是CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的重要課題,！
Fanconi貧血途徑活性影響基因敲除和基因編輯
而且，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)里,，F(xiàn)ANCD2蛋白能且只能在Cas9切開的位點(diǎn)積聚,，那么它就可以作為Cas9切口的有效標(biāo)志，這就可以幫助科學(xué)家們快速準(zhǔn)確地找出靶向和脫靶的切口,。
研究人員指出,，這項(xiàng)研究有助于加深我們對(duì)CRISPR/Cas9機(jī)制的進(jìn)一步理解,，有望提高基因編輯的效率，從而開發(fā)出更多有效的療法,，為更多疾病帶來(lái)希望,。
（轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)）
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