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大腸桿菌表達外源蛋白的策略
大腸桿菌表達系統(tǒng)是發(fā)展zui早,、目前zui為成熟的表達系統(tǒng)。因其遺傳背景清楚,、繁殖快,、成本低、表達量高,、表達產(chǎn)物容易純化,、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等,，是基礎研究和商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的強大工具,；但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如重組蛋白不穩(wěn)定，生物活性低,，以包涵體形式表達,。外源基因在大腸桿菌中的表達效率受多個因素的影響，在表達前對目的蛋白進行分析和優(yōu)化,，才能實現(xiàn)目的蛋白的表達,，主要包括如下幾個方面：
(1) 表達載體的選擇，表達載體啟動子的選擇很重要,，啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與 RNA 聚合酶的親和力,，從而影響了基因表達的水平，理想的啟動子應該滿足：①具有強啟動性,，能指導轉(zhuǎn)錄以保證目的蛋白的高產(chǎn)量,；②可嚴謹調(diào)控,，在一定條件下開始誘導表達，可zui大限度降低細菌的代謝負荷和外源蛋白的毒性作用,。其他如 SD 序列位置和轉(zhuǎn)錄終止子,，也會影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。
(2) 密碼子優(yōu)化,，含有大量稀有密碼子的基因在大腸桿菌中表達時,，由于大腸桿菌缺乏某幾種 tRNA，會降低 mRNA 的翻譯效率和穩(wěn)定性,，甚至會造成翻譯錯誤或提前中止,。對目的基因進行密碼子改造，可以提高 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率,。
(3) 融合蛋白及分子伴侶,，融合蛋白不僅可以作為親和標簽利于下游純化操作，而且大分子融合蛋白還能增加蛋白的可溶性表達,，如谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶 (GST),SUMO 蛋白,，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），親水性強,，有助于提高靶蛋白的可溶性和穩(wěn)定性,；共表達分子伴侶可促進重組蛋白的翻譯后折疊加工，提高蛋白可溶性和穩(wěn)定性,。大腸桿菌系統(tǒng)中常用的有 GroEL 和 GroES 體系,；熱休克蛋白 DnaK，DnaJ 和 GrpE 三元體系,；Dsb 家族 (二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶),，能夠促進二硫鍵的形成。
(4) 靶蛋白的定位表達,，重組蛋白在大腸桿菌中合成后有 4 種定位, 即胞質(zhì),、周質(zhì)空間、內(nèi)膜或外膜和細胞外基質(zhì)中,。利用信號肽將重組蛋白分泌到細胞周質(zhì)或胞外培養(yǎng)基中, 細胞周質(zhì)空間的氧化環(huán)境利于二硫鍵的形成和硫基蛋白的正確折疊,；周質(zhì)空間中的蛋白酶要比胞內(nèi)低很多，減少靶蛋白的降解,；周質(zhì)空間中的蛋白數(shù)量也較胞內(nèi)少很多,，利于靶蛋白的純化。
(5) 表達菌株的選擇,，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多,，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。Rosetta2 系列補充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子對應的 tRNA（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC,GGA 及 CGG）,，提高外源基因,、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平；K-12 衍生菌 Origami 2 系列,，trxB 和 gor 雙突變菌株,，顯著提高細胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性表達,。Rosetta-gami™則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點,，既補充 7 種稀有密碼子，又能夠促進二硫鍵的形成,，幫助表達需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白,。
(6) 誘導條件，培養(yǎng)條件對重組蛋白的表達也很關(guān)鍵的,，例如溫度，溫度較高時蛋白表達量高但容易形成包涵體,，而溫度低時蛋白表達量低,，但可以提高目的蛋白的可溶性；誘導物的濃度也同樣影響重組蛋白的表達效率,，如低濃度 IPTG 誘導可以提高可溶蛋白的含量,。另外培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，pH 和其它參數(shù)都可以影響蛋白酶的活性,，分泌和表達水平,。
在大腸桿菌中表達外源蛋白，表達前的分析非常重要,，對目的基因和蛋白進行具體分析,，綜合考慮，選擇的表達體系和方法,，才能實現(xiàn)外源蛋白的表達,。