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DNA 甲基化修飾
DNA 甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，能通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu),、DNA 構(gòu)想,、穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)相互作用方式等,，起到調(diào)控基因表達的作用,。與多種腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展密切相關(guān)。
DNA 甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個重要因素,。這些變化包括 CpG 島局部的高甲基化和基因組 DNA 低甲基化狀態(tài),。它是由 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methy-transferase，Dnmt）催化,，以 3-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體而發(fā)生反應(yīng)。催化反應(yīng)有 3 類,，包括將腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)?N-甲基腺嘌呤,、將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?N-甲基胞嘧啶以及將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?C-甲基胞嘧啶,。在原核生物中這 3 種類型均存在,，但是在高等真核生物中只存在第 3 種類型，即將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)?5-甲基胞嘧啶（5mC）,。
如圖 1 左所示,，在正常細(xì)胞中,，位于抑癌基因啟動子區(qū)域的 CpG 島處于低水平或未甲基化狀態(tài)，此時抑癌基因處于正常的開放狀態(tài),，抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發(fā)生,。而在腫瘤細(xì)胞中,，該區(qū)域的 CpG 島被高度甲基化,，染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，抑癌基因的表達被關(guān)閉,，從而導(dǎo)致細(xì)胞進入細(xì)胞周期,，凋亡喪失，DNA 修復(fù)缺陷,，血管生成以及細(xì)胞粘附功能缺失等,，zui終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
同樣,，如圖 1 右所示,，對于在正常細(xì)胞中處于高度甲基化的一些基因和重復(fù)序列,，如果其甲基化水平降低,，這些基因?qū)⒈磉_和重復(fù)序列將激活,，從而導(dǎo)致基因印記丟失，細(xì)胞過度增長,，不合適的細(xì)胞特異性表達，基因組脆性增加,，以及內(nèi)寄生序列 (endoparasitic sequence) 激活,，zui終也導(dǎo)致腫瘤發(fā)生,。
由于 CpG 島的局部高度甲基化要早于細(xì)胞惡性增生,，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預(yù)測,，可以作為腫瘤等早期診斷的生物標(biāo)記物和預(yù)后評估指標(biāo),，對腫瘤的篩查和風(fēng)險評估、早期診斷,、分期分型,、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測都具有重要的意義。而全基因組水平的低水平甲基化狀態(tài),，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進一步降低,，使其可用于腫瘤的診斷以及分級。
隨著 DNA 甲基化研究的不斷深入,，其檢測方法也層出不窮?，F(xiàn)有方法，絕大部分都是取樣于細(xì)胞的 DNA,，根據(jù)研究水平,，又將這些方法歸為 3 大類，即：基因組甲基化水平 (Methylation Content) 的分析,，候選基因甲基化的分析以及基因組層次的 DNA 甲基化模式 (Methylation pattern) 與甲基化譜 (Methylation Profiling) 的分析,。
A. 基因組甲基化水平 (Methylation Content) 的分析:
1. 液相色譜 ( HPLC) ：HPLC 是一種比較傳統(tǒng)的方法，是根據(jù) DNA 或 蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離,。由于在 動態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以 定量,。隨著系統(tǒng)的壓強的增加，其分辨率增高,。故 而能夠定量測定基因組整體水平 DNA 甲基化水平,。
2. 毛細(xì)管電泳法 ( HPCE) ：這是一種利用窄孔熔融石英毛細(xì)管來從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷,，大小,，結(jié)構(gòu)以及疏水 性等不同而相互分開。用 HPCE 方法處理 DNA 水解產(chǎn)物來確定 5mC 水平,，簡便,，經(jīng)濟且敏感性高。 必須指出,，以上方法雖然能夠明確檢測出目的序列中所有 CpG 位點的甲基化狀況,，但并不能對甲基化位點進行定位。
B. 候選基因 (Candidate Gene) 甲基化分析:
1 . 甲 基 化 敏 感 性 限 制 性 內(nèi) 切 酶 - P C R / Southern 法 ( MSRE-PCR/ Southern) ：這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對甲基化區(qū)的不切割的特性,，將 DNA 消化為不同大小的片段后,，進行 Southern 或 PCR 擴增分離產(chǎn)物,， 明確甲基化狀態(tài)再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(CCGG) 和 SmaⅠ- Xmal(CCCGGG),。
2. 重亞硫酸鹽測序法 (Bisulphite Sequencing) ：該方法首先用重亞硫酸鹽使 DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶保持不變，進行 PCR 擴增所需片段,，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，zui后,，對 PCR 產(chǎn)物進行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較,，判斷是否 CpG 位點發(fā)生甲基化。此方法是度很高,，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的甲基化狀態(tài),，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣,、昂貴,。
3. 甲基化特異性的 PCR (MS-PCR) ：同樣，該方法中,，DNA 先用重亞硫酸鹽處理,，隨后行引物特異性的 PCR。其設(shè)計兩對引物,，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對,，即一對結(jié)合處理后的甲基化 DNA 鏈，另一對結(jié)合處理后的非甲基化 DNA 鏈,。檢測 MS-PCR 擴增產(chǎn)物,，如果用針對處理后甲基化 DNA 鏈的引物能擴增出片段，則說明回目錄 該被檢測的位點存在甲基化,；反之亦然,。
C. 基因組范圍的 DNA 甲基 化模式 (Methylation pattern) 與 甲 基 化 譜 ( M e t h y l a t i o n Profiling) 分析:
1 . 限 制 性 標(biāo) 記 基 因 組 掃描 (Restriction Landmark GenomicScanning, RLGS) RLGS 是zui早適用于基因組范圍 DNA 甲基化分析的方法之一。該方法先用甲基化敏感的稀頻限制性內(nèi)切酶 NotⅠ消化基因組 DNA,，甲基化位點保留,，標(biāo)記末端、切割,、行一維電泳,，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的內(nèi)切酶切割，行二維電泳,，這樣甲基化的部分被切割開并在電泳時顯帶,，得到 RLGS 圖譜與正常對照得出缺失條帶即為甲基化的可能部位。
2 . 甲 基 化 間 區(qū) 位 點 擴 增 (ampl ification of intermethylated sites, AIMS) A I M S 是 基 于 任 意 引 物 PCR (Arbitrary Primed PCR) 的一種方法,，由于任意引物 PCR 使用寡核苷酸連接子 (linker) 進行連接,，不需要依賴任何序列的先驗信息,。在該方法中，用來進行擴增的模板序列首先通 過甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶進行消化而富集,，其特異性由該酶酶切片斷一端的特定序列 結(jié)合連接子來保證,。隨后，由內(nèi)切酶進行第二次消化,，再次連接,，提純進行 PCR 擴增，zui后電泳,，提取目的序列進行測序,。
3 . 甲 基 化 C p G 島 擴 增 (Methy lated CpG-i s land amplification, MCA) M C A 也是基于任意引物 PCR 的方法，該方法使用兩種對甲基化具有不同敏感度的限制性內(nèi)切酶 (如 SmaI 和 XmaI) 先后進行消化,，然后對甲基化敏感的限制性酶切片斷進行接頭 (Adaptor) 連接,，行 PCR，那些富含 CpG 的序列就會被選擇性的擴增,。該方法對甲基化分析和克隆甲基化差異性基因都非常有幫助,。
通過以上論述，不難看到檢測甲基化的方法不斷涌現(xiàn),，一方面說明其研究難度之大,，另一方面也說明種種方法都有其局限性，諸如對酶的依賴,，PCR 擴增的問題,，芯片數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題等等。 綜上所述,，各種表觀基因組學(xué)技術(shù)方法使我們可以繪制出諸如 DNA 甲基化以及組蛋白修飾模式的詳細(xì)圖譜,，為我們研究甲基化的生物學(xué)功能，以及在腫瘤生成中的作用,，以致腫瘤預(yù)防,、診斷、治療和預(yù)后方面提供更多信息,。