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重組羧肽酶B 的性質(zhì)與抗體堿性峰檢測
羧肽酶 B (EC 3.4.17.2) 專一用于蛋白質(zhì) C-末端堿性氨基酸（賴氨酸,、精氨酸、組氨酸）的水解,；又稱為肽酰-L-賴氨酸（L-精氨酸）水解酶,；精蛋白酶,。分子量為 35kD,，等電點(diǎn)為 6.0，zui適 pH 為 7-9,。羧肽酶 B 是抗體堿性峰檢測的特異酶,，通過比較酶切前和酶切后的圖譜來計算抗體堿性變體的比例，對于抗體的發(fā)酵工藝和純化工藝穩(wěn)定性的控制都具有重要的意義,。
而在抗體堿性峰的檢測中,，沒有*統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如酶解緩沖液酶的用量,，酶解時的溫度和時間等,。而這些與酶的性質(zhì)密切相關(guān)。
可以選擇的羧肽酶 B 有兩種,，一種是動物胰腺提取的羧肽酶 B,，一種是基因工程的重組羧肽酶 B，前者由于胰腺中含有各種蛋白酶,，如胰蛋白酶,、糜蛋白酶等，常常不能*去除,，在酶切時會有非特異的酶切雜峰出現(xiàn),，影響結(jié)果判斷。后者為基因工程生產(chǎn)的,，成分單一,，無雜酶,，比活高，應(yīng)用上更有優(yōu)勢,。
羧肽酶 B 的結(jié)構(gòu)
天然存在的羧肽酶 B 是由前羧肽酶原 B（preprocarboxypeptidase B,，preproCPB）經(jīng)酶解產(chǎn)生，后者 N-末端包含 108 個氨基酸（其中 13 個氨基酸為信號肽序列,，95 個氨基酸組成前導(dǎo)肽部分）的多肽片段與 CPB 相連,。前羧肽酶原 B 在轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中，信號肽被切掉,，得到無酶活性的羧肽酶原 B（procarboxypeptiedase B, proCPB）并從細(xì)胞中分泌出來,，zui終在小腸中經(jīng)胰蛋白酶在 Arg-95 處酶解，成為具蛋白酶活性的 CPB,。proCPB 的分子量為 46kD,，由 401 個氨基酸組成；CPB 分子量為 35kD,，由 306 個氨基酸組成（如圖 1）,。在CPB 中，前體的活化主要依賴胰蛋白酶在 Arg95 位的切割,，半球形前導(dǎo)肽被切割后,，它既不會抑制酶體，也不再與之結(jié)合,，這使得酶體能迅速發(fā)揮功能,，并對前導(dǎo)肽 C-端的 Arg 進(jìn)行切割。
圖 1 羧肽酶原 B 的三維結(jié)構(gòu)及其激活部位示意圖
（上面暗紅色部分代表前肽,，下面藍(lán)色部分代表羧肽酶 B,，箭頭所指為胰蛋白酶酶切激活位點(diǎn)）羧肽酶 B 的性質(zhì)取重組羧肽酶 B 凍干粉，純度見圖 2,。研究了重組羧肽酶 B 的zui適 pH,，zui適溫度，pH 穩(wěn)定性及溫度穩(wěn)定性,，對于 CPB 的使用起到指導(dǎo)作用,。同時做了溶液的反復(fù)凍融穩(wěn)定性，對于 CPB 酶液的儲存和使用起到指導(dǎo)作用,。
圖 2 純化后重組羧肽酶 B 的電泳分析
1,、羧肽酶 B 的 pH 穩(wěn)定性
將純的重組羧肽酶 B 用純水溶解為 10 mg/ml，之后用以下緩沖液稀釋使酶液的終濃度為 1 mg/mL,，pH 分別為 3.0,、4.0、5.0、6.0,、6.5,、7.0、7.5,、8.0,、8.5、9.0,、10.0,、11.0、12.0,， 25℃ 孵育 12 h 后測活,。結(jié)果見圖 3（左）。
2,、羧肽酶 B 的zui適 pH
測定 rCPB 純酶液濃度為 1 mg/mL, 在不同 pH 條件下的催化速率,，底物濃度為 0.1 mM/L，pH 分別為 3.0,、4.0,、5.0、6.0,、6.5,、7.0、7.5,、7.65,、8.0、8.5,、9.0、10.0,、11.0,、12.0，pH3.0-5.0 用 50 mMNaAc-HAc 緩沖液配制,，pH6.0-7.0 用 50 mMKPB 磷酸鹽緩沖液配制,，pH7.5-8.5 用 50 mM Tris-HCl 緩沖液配制，pH9.0-12.0用 50 mM Gly-NaOH 緩沖液配制,。結(jié)果見圖 3（右）,。
圖 3 rCPB 酶液的 pH 穩(wěn)定性（左）和zui適反應(yīng) pH（右）CPB 在 pH7.0-9.0 緩沖液中穩(wěn)定，25℃ 孵育 12 h 無活性損失,；zui適 pH 表明,，在 pH7.6 活性zui大，在 pH7.5-pH8.5 活性均可以,。在 pH≤7 和 pH≥10 時,，基本無活性,。
3、羧肽酶 B 的溫度穩(wěn)定性
將 rCPB 酶液配成濃度為 1 mg/mL,，置于 4℃,、25℃、30℃,、40℃,、50℃、60℃ 條件下,，每個溫度三個平行,，時間定為 15 min、30 min,、1 h,、2 h、4 h,、8 h,、20 h 分別取樣測定其活性，以初始時酶活定為 100%,，以殘余酶活百分比表示測定結(jié)果,。
4、羧肽酶 B 的zui適催化溫度
在不同溫度下恒溫水浴測活底物,，使底物的溫度分別為 4℃,、25℃、30℃,、40℃,、50℃、60℃,、70℃,、80℃，取適量 rCPB 純酶液,，測定活力,。以 254nm 吸光值 OD254 為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo),，結(jié)果表示見圖 4（右）,。
圖 4 rCPB 酶液的溫度穩(wěn)定性（左）和zui適催化溫度（右）CPB 在 40℃ 以下保溫 10 h，均活性穩(wěn)定,。zui適催化溫度顯示,，在 3 min 內(nèi)，40℃以下均可保持良好的線性，其中,，以 25℃ 為*,。
5、羧肽酶 B 酶液的反復(fù)凍融穩(wěn)定性
將 rCPB 酶液反復(fù)凍融,，測定每次凍融后的酶活,，計算活力保留率，得到同一管 rCPB 反復(fù)凍融 10 次后的活力穩(wěn)定性（如圖 5）,。
圖 5 rCPB 酶液的反復(fù)凍融穩(wěn)定性
結(jié)果表明重組羧肽酶 B 反復(fù)凍融穩(wěn)定性好,。經(jīng)過 10 次的反復(fù)凍融，幾無活性損失,。
抗體堿性峰檢測
羧肽酶 B 的準(zhǔn)備：用 1X PBS pH7.5, 溶解羧肽酶 B 至 1 g/L,，分裝后-20℃ 保存。
抗體：純化后的單抗樣品超濾至磷酸緩沖液（pH=7.5）中（1~2 g/L）,。
酶用量：按樣品：酶= 20:1-100:1,，此處用量為 100:1。
孵育溫度及時間：37℃ 反應(yīng) 30 分鐘,。
檢測：直接進(jìn)樣 HPLC 檢測,。
結(jié)果見圖 6。
圖 6 抗體經(jīng) CPB 處理和未處理的圖譜比較
圖 7 Rituimab 羧肽酶 B 處理前后比較圖（摘自 Rituximab 的 USP 驗(yàn)證報告）在 Rituximab 的 USP 驗(yàn)證報告中,，規(guī)定了酸,、堿性變體的含量。規(guī)定 Rituximab的酸性變體 NMT 12.0% ,，堿性變體 NMT 10.0%,。鑒定方法為 CPB 處理前后的HPLC 比較。