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鎳柱純化常見問題及分析
1:通過His標(biāo)簽純化的蛋白,，雜帶比較多,，如何改進(jìn)？
（1）如果純化的是上清,，蛋白酶會部分降解目的蛋白,，可通過加多種入蛋白酶抑制劑改進(jìn)。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度,，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力,。
（3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100),。
2:鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?
(1)出現(xiàn)這樣的情況,，主要是緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下,，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀,，所以所有鎳柱的生產(chǎn)商都強(qiáng)調(diào)要盡量避免DTT的參與（一般的鎳柱耐受小于5mMDTT,推薦緩沖液中不要超過2mMDTT）。
3:柱子堵了,，怎么辦,？
（1）柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致,，所以樣品一定要高速離心,。
（2）上清液純化時，蛋白發(fā)生變性,，有絮狀物產(chǎn)生,，趕緊加入1-2mMDTT(上清樣品處理要在冰浴中進(jìn)行),，還不行加尿素變性，使其在變形環(huán)境下,。
（3）樣品處理時的料液比不要太小,，否則黏度大，或者導(dǎo)致蛋白析出或變性,，料液比要在1/10-1/15之間較適宜,。
4：純化過程中，蛋白出現(xiàn)了渾濁,，怎么辦,？
（1）出現(xiàn)渾濁，說明蛋白處在不穩(wěn)定的環(huán)境中或者自身就不穩(wěn)定,，所以要檢查緩沖體系是否正確,，環(huán)境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑DTT,。
（2）加入肌氨酸鈉,，迅速使蛋白變性，消除渾濁現(xiàn)象,。
5：沒能純化到帶His標(biāo)簽的蛋白,，蛋白都流穿了（未掛柱）？
（1）超聲的功率不對(太大,，蛋白炭化,，太小，蛋白沒有釋放)策略：改變超聲功率,，并在超聲前加入溶菌酶,。
（2）樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確：策略：檢測pH及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份（EDTA等）。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及起始咪唑的濃度不是太高,。
（3）組氨酸的標(biāo)簽沒有*的暴露策略：在變性條件下(用8M脲,，6M鹽酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT進(jìn)行純化。
（4）His標(biāo)簽丟失,策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達(dá),，上游構(gòu)建,，改變his-tag的位(C-terminalorN-terminal)，必要時增加his個數(shù)(常用6-10個),。策略2：孵育的時間不夠,，降低流速和增加孵育的時間。策略3：改變螯合的金屬離子,，尋找到*的結(jié)合金屬離子,。
Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)(組氨酸)6標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的金屬離子，也是一般zui常用的離子,。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響,，包括長度,、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度,、所用離子的類型,、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用Ni2+,?？梢岳肏itrapIMACHP來篩選不同的金屬離子，具體應(yīng)用實例請參考《RecombinantProteinPurificationHandbook》,。
6:蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決？
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上,，結(jié)合力較強(qiáng)）策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來找出*的洗脫條件,。
（2）降低PH的方法洗脫的,因為若PH低于3.5,會導(dǎo)致鎳離子脫落策略：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
（3）蛋白已沉淀在柱上 策略：減少上樣量和孵育的時間，試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)
或改變NaCl的濃度,，或在變性條件下洗脫(用8M脲,，或6M鹽酸胍)，zui終也可在洗脫Buffer中加入2mMDTT或者0.5%肌氨酸鈉進(jìn)行洗脫,。
（4）非特異性疏水或其他相互反應(yīng)策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如,，2%TritonX-100）或增加NaCl的濃度。
7：如何處理樣品,，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）,？
（1）上清樣品處理，要加入去污劑,，蛋白酶抑制劑,，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數(shù),。
（2）去大腸桿菌自身帶（兩條30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸?。尤肴ス竸x心6000r/min,30min,10℃,。（若效果不夠可繼續(xù)上述步驟）,。
（3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍,，也可用1M/2M/4M/8M尿素逐步溶解,，可選取其中純度*的。
（4）可用硫酸銨測定法,，可初步提純,。