您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
12
多聚組氨酸標(biāo)簽（His-tag）
固定化金屬離子親合層析(Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)，簡稱金屬螯合親合層析,，是一種新型的應(yīng)用于原核蛋白純化的技術(shù)。該方法通過蛋白質(zhì)表面的一些特殊的氨基酸，使之與金屬離子發(fā)生相互作用，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化,。這些作用包括配價鍵結(jié)合、靜電吸附,、共價鍵結(jié)合等,，其中以6個組氨酸殘基組合的融合標(biāo)簽（His-Tag）在原核蛋白表達(dá)中的應(yīng)用zui為顯著。
His-Tag可結(jié)合在目的蛋白的C末端或N末端,，形成特殊的結(jié)構(gòu)，以便于進(jìn)行下一步的純化及檢測,。由于金屬螯合親合層析具有配體簡單,、吸附量大、分離條件溫和,、通用性強(qiáng)等特點,，所以可選擇范圍廣，高鹽,，存在變性劑以及去垢劑的上樣條件下進(jìn)行純化,，His-Tag正逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品zui有效的技術(shù)之一。
His-tag作為蛋白純化時的標(biāo)簽,，其優(yōu)勢在于：
1.N-端的His-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容,，有利于蛋白表達(dá)；
2.采用IMAC（固定化金屬離子親合層析）純化His-Tag融合蛋白操作更加簡便,；
3.His-Tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響,，不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；
4.His-Tag非常小,，在融合蛋白結(jié)晶后對蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響,；His-Tag的免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射入動物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體,；
5.與其它親和標(biāo)簽構(gòu)建成雙親和標(biāo)簽,，并可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)；
His-Tag融合蛋白的適用范圍也較廣，既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化,，也可以在變性條件下進(jìn)行純化,。前者通常用來純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白,。
His-Tag親和層析填料
His-Tag可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用,，如Ca2+、Mg2+,、Ni2+,、Cu2+，F(xiàn)e3+等,，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的特性,，使之被吸附在凝膠柱上，從而達(dá)到分離純化蛋白的目的,。
Ni2+在親和純化實驗中的使用,。根據(jù)結(jié)合基團(tuán)的不同，Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA和Ni-NTA,。Ni2+有六個螯合價位,，其中Ni-IDA螯合了三價，Ni-NTA螯合了四價,。所以IDA的載量要比NTA的高,，在同樣條件下Ni-IDA洗脫時的咪唑濃度也高于Ni-NTA。但其弱的結(jié)合力使金屬離子在洗脫階段時很容易浸出,，與目的蛋白緊密結(jié)合,，從而導(dǎo)致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問題,。而NTA的顆粒粒度均勻,，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定,，能耐受較高的還原劑,，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落,。
IMAC在通常的情況下是比較穩(wěn)定的,，但螯合劑的存在則會導(dǎo)致其金屬離子脫落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑,，如在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生了二羧酸類物質(zhì),。因此，E.coli在某些高壓情況下就會產(chǎn)生高特異性的金屬螯合劑（通常存在于細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)中）,，導(dǎo)致His-Tag融合蛋白純化的純度和產(chǎn)量大大降低,。所以在進(jìn)行純化His-Tag融合蛋白的實驗時,，首先需要去除螯合劑。
Ni-NTA親和層析實驗
Ni-NTA分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白
1.Ni-NTA裝柱,，1.6×20cm,，柱床體積為10ml；
2.用緩沖液1平衡2~5個床體積,，流速為2ml/min,；
3.將20ml細(xì)胞破碎液(50mMPBS，pH7.4,，0.5MNaCl)0.45um濾膜過濾,，上樣，流速為1ml/min,；
4.用緩沖液1再洗2~5個床體積,，流速為2ml/min；
5.用分別含10,、20,、50、100,、200,、300、400mM咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫,，流速為2ml/min,，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度,；
6.用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積,，流速為2ml/min,，柱子置于低溫環(huán)境中保存。
緩沖液組成：
緩沖液1：50mMpH7.4的PBS緩沖液,。
配制：0.5MNaH2PO419ml,，0.5MNa2HPO481ml，NaCl29.3g,，加適量水溶解后定容到1000ml,。
緩沖液2：50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4,，即pH7.4的PBS溶液,。
配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml,，NaCl29.3g和咪唑34g,加適量,，水調(diào)pH后定容到1000ml,。
緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B
配制：
咪唑洗脫原理：Ni柱中的氯化鎳可以與有His-Tag的融合蛋白結(jié)合，也可以與咪唑進(jìn)行結(jié)合,，當(dāng)標(biāo)簽蛋白與層析柱表面珠孔內(nèi)的鎳離子介質(zhì)發(fā)生結(jié)合時,，不同濃度的咪唑通過層析柱，就會將與鎳配位的標(biāo)簽蛋白,，雜蛋白等分別洗脫下來,，從而得到高純度目標(biāo)蛋白。
附錄：Ni-IDA和Ni-NTA的一些參數(shù)對比
