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ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱(chēng)ChIP）是研究活體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù),。它利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結(jié)合的狀況,。隨著對(duì)基因功能研究的不斷深入,，這項(xiàng)技術(shù)正越來(lái)越多的被應(yīng)用于科研的各個(gè)領(lǐng)域。
ChIP的原理
把生理狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái),，然后可進(jìn)行后續(xù)的DNA序列測(cè)序鑒定等,。
ChIP實(shí)驗(yàn)步驟
ChIP經(jīng)驗(yàn)分享
ChIP實(shí)驗(yàn)操作性很強(qiáng)，下面總結(jié)了一些ChIP實(shí)驗(yàn)中您可能會(huì)遇到的棘手的問(wèn)題,，下面我們就一起來(lái)分享一下吧,！
細(xì)胞固定
1、甲醛終濃度為1%較適宜,；
2,、固定時(shí)間一般為5-60min較好，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定,。,；
染色質(zhì)斷裂
1、 超聲時(shí)斷時(shí)續(xù),，保證低溫,；
2、 注意探頭位置,，防止產(chǎn)生泡沫,；
3、 研究組蛋白需使用酶處理,；
染色質(zhì)免疫沉淀
1,、 有Input對(duì)照,，Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中
的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量,，按照取樣比例換算出ChIP的效率,，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。
2,、 抗體的選擇是關(guān)鍵,。抗體的選擇要注意三點(diǎn)：一是應(yīng)該選擇能夠做ChIP實(shí)驗(yàn)的抗體,。
盡量選擇ChIP級(jí)別商業(yè)化的抗體,。如沒(méi)有，一般可以重組到帶有標(biāo)簽的載體上,，再轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主（目前市面上商業(yè)化的chip抗體只有300多種,，因此正好找到對(duì)應(yīng)抗體較困難，可以選擇標(biāo)簽抗體）,。二是抗體的結(jié)合位點(diǎn),。選擇單抗的話(huà)，盡量遠(yuǎn)離抗原和染色質(zhì)相結(jié)合的位點(diǎn),，這樣可以大限度保證抗體和抗原的結(jié)合,，而多抗可識(shí)別多個(gè)表位，可基本避免該風(fēng)險(xiǎn),。因此單多抗各有優(yōu)缺點(diǎn),，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該抗體是否經(jīng)過(guò)ChIP驗(yàn)證。三是抗體的濃度,?？贵w濃度的也很重要，濃度太低,，不能與靶蛋白*結(jié)合,。濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶增加背景。
3,、 陰性對(duì)照可以使用血清或lgG，陽(yáng)性對(duì)照一般使用RNA Polymerase II或者組蛋白,。
陰性對(duì)照：用實(shí)驗(yàn)抗體同型的IgG作為抗體,，理論上不會(huì)ChIP下來(lái)任何DNA片段，因此作為陰性對(duì)照,，但是由于非特異結(jié)合,，或者實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)發(fā)生結(jié)合的DNA清除不*,，可能也會(huì)出現(xiàn)條帶,。如果陰性對(duì)照樣品中的產(chǎn)物量等于特異靶標(biāo)樣品中產(chǎn)物量,，說(shuō)明特異靶標(biāo)抗體未發(fā)揮作用或者染色質(zhì)斷裂不充分。
陽(yáng)性對(duì)照：為了保證陽(yáng)性對(duì)照有效,，一般選擇陽(yáng)性對(duì)照的引物是根據(jù)管家基因設(shè)計(jì)的,。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（組蛋白）抗體，因?yàn)镽NA Polymerase II是通用轉(zhuǎn)錄因子,，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動(dòng)子區(qū),。因此，理論上ChIP后PCR都會(huì)有條帶,。
4,、 需設(shè)計(jì)已經(jīng)確定的、不與特異抗原相結(jié)合的DNA片段的引物,，用來(lái)排除抗原和染色質(zhì)的
非特異結(jié)合,。
交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)
1、 RNA酶,、蛋白酶需65℃保溫6小時(shí)
2,、 不加蛋白酶可以提取、分析結(jié)合蛋白
DNA的純化
推薦用試劑盒,，便于后面的PCR檢測(cè)
DNA的鑒定
可以進(jìn)行二代測(cè)序或者QPCR檢測(cè)結(jié)果
因?yàn)镃hIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多,，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對(duì)照,，而且對(duì)結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn),。