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菲羅門技術(shù)部電話日常：
— 我（ 董麗華）：您好,，菲羅門技術(shù)部,，請問有什么可以幫助您？
— 客戶：新柱子,，測出來的柱效咋這么低,？柱子是不是有問題？腫么回事,？
我內(nèi)心：“聽,，那是心碎的聲音。死亡三聯(lián)問,，擊碎了我弱小脆弱的心,。突然想到，與其每次授人以魚,，不如借此平臺(tái)授人以漁,。”
言歸正傳嘍
首先，常識(shí)是：新色譜柱拿到手里,，一定要進(jìn)行色譜柱效能測試,。這樣，先判斷這根色譜柱是否是合格品,，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是,，及時(shí)測試柱效后發(fā)現(xiàn)問題。
一經(jīng)核實(shí),，可向廠家提出退換貨。一旦色譜柱正常使用,，后續(xù)再出現(xiàn)問題,，用戶很難向廠家申請到退換貨的。所以,，做新柱子的性能測試,，可以保證您的利益。
我們先來了解下色譜柱效能評價(jià)（以下以反相色譜柱作為例子）
一、反相色譜柱評價(jià)條件
對于一根填充柱來說,，基本的柱性能評價(jià)指標(biāo)是柱效和峰對稱的測定,。反相色譜柱評價(jià)所需常用的流動(dòng)相一般是甲醇或者乙腈與水的體系，對于含有酸堿性組份的樣品,，流動(dòng)相為甲醇或者乙腈與緩沖鹽的體系,；檢測波長一般在254nm下檢測，因?yàn)樵诖瞬ㄩL處,，甲醇,、乙腈，磷酸緩沖鹽均沒有紫外吸收,，而且標(biāo)準(zhǔn)樣品多為含苯環(huán)的物質(zhì),，在254nm波長紫外吸收強(qiáng)，選擇此波長檢測可以避免流動(dòng)相戲外吸收的干擾,；柱溫一般在室溫下測定,，均不超過30℃；對于通常的標(biāo)準(zhǔn)柱型,，即Φ4.6mm×250mm的柱子來說,，流速以1ml/min為宜。
柱壓則為實(shí)測值,，它不僅與色譜柱有關(guān),，而且取決于流動(dòng)相，以及評價(jià)色譜柱的溫度與流速,。
二,、反相色譜柱評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
通常,以的一組標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)為樣品,測定它們在柱子上的理論塔板數(shù)，以作為柱效的衡量指標(biāo),。這種標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)的選擇,，因不同的色譜模式而異，也因不同的使用目的而有所不同,。一般情況下,，僅選用3-4中中性，例如芳香烴,，多選用5種,。要求它們具有不同的保留因子（例如，個(gè)化合物k=0,，其余的在2～10范圍內(nèi)）,，能反映出對柱子性質(zhì)的基本要求，而且能在一般的HPLC裝置上得到清晰的信號,。反相色譜柱評價(jià)所用的標(biāo)準(zhǔn)樣品各不相同,，
采用NaNO3,NH2NO3，尿嘧啶，硫脲等作為樣品,，進(jìn)行死時(shí)間的測定,，一般可得較近的結(jié)果。雖然很多資料證實(shí)尿嘧啶有保留,，但因其峰型相對較好等原因一直得到廣泛得應(yīng)用,。
衡量柱效的物質(zhì)則千差萬別，由苯,、萘,、菲或苯、甲苯,、二甲苯等,，一般以后洗脫出的組分衡量柱效（可以弱化死體積的影響外，同時(shí)與色譜柱填料充分接觸）,。
衡量色譜柱分離堿性樣品的柱效,，不對稱度，可用阿米替林,。
三,、可能的影響柱效的因素（除色譜柱本身）
這里我們先不談峰的對稱性，當(dāng)峰不對稱的時(shí)候,，柱效一定低的,，我們暫時(shí)只考慮柱效低的影響因素有哪些。
柱外效應(yīng)是指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的成因,，從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測器之間色譜柱以外流路部分,，主要由進(jìn)樣裝置、檢測池及它們與柱之間的連接管路所產(chǎn)生,，并對柱效能產(chǎn)生的影響,。
進(jìn)樣裝置的影響：例如手動(dòng)進(jìn)樣，樣品注射的速度影響樣品的擴(kuò)散范圍大小,，使峰展寬,，影響柱效。
檢測池的影響：檢測池體積大,，使樣品被流動(dòng)相稀釋,，不僅會(huì)降低檢測靈敏度，還使峰展寬,。除了池體積大小的影響外,，池的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（幾何形狀）和池內(nèi)的流動(dòng)特性（從連接管到樣品池由于直徑變化引起的）都會(huì)影響峰展寬。假如樣本同時(shí)達(dá)到檢測池,，通過縱向和橫向擴(kuò)散，在檢測池中擴(kuò)散的范圍值為檢測室的體積。所以池體積小,，峰展寬會(huì)小,。目前使用的檢測池體積大多數(shù)都小于等于8μL，對于常規(guī)分析一般沒有多大影響,。另外,，當(dāng)使用小體積柱時(shí)，故希望檢測池體積小于5μL,，微量色譜柱的體積應(yīng)減少到1μL,，甚至更小。
連接管對色譜峰擴(kuò)展的影響,，是由于流動(dòng)相在空管中的流動(dòng)速度分布的縱斷面呈拋物線狀,，管中心的樣品分子比管壁部分的樣品分子先到達(dá)樣品池，因此引起了峰擴(kuò)展,。檢測池與色譜柱出口的連接,，或者幾個(gè)檢測器之間的連接，應(yīng)采用細(xì)內(nèi)徑連接管并控制短的距離,，以使峰擴(kuò)展小,。但應(yīng)注意，連接管內(nèi)徑減小時(shí),，管內(nèi)壓力降會(huì)有所增加,。一般*使用內(nèi)徑0.1mm(或0.2mm)的不銹鋼或PEEK管,長度應(yīng)盡可能地短。
題外話：有時(shí)候做方法時(shí),，理論上兩個(gè)物質(zhì)的分離度大于1.5,，但實(shí)際*達(dá)2.0，因?yàn)椴煌瑑x器的樣品池和連接管對峰擴(kuò)展的貢獻(xiàn)有可能使在色譜柱上已經(jīng)分離了的組分在樣品池中又重疊混合,，轉(zhuǎn)移后的方法重現(xiàn)不出,。
檢測器的參數(shù)影響。檢測器的時(shí)間常數(shù)包括檢測器傳感器和電子元件的響應(yīng)時(shí)間,，它間接對色譜系統(tǒng)的小檢測量和低檢測濃度產(chǎn)生影響,。一般說來，傳感器的響應(yīng)較快,。而檢測器放大器和記錄儀的時(shí)間常數(shù)有可能過大,，使色譜峰變形失真，導(dǎo)致柱效下降,，也影響色譜分析的可靠性和準(zhǔn)確性,。目前使用的檢測器和記錄儀的時(shí)間常數(shù)一般在0.5s-1.0s 就是合適的。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與進(jìn)樣體積的影響,。用兩個(gè)（正常至超載連續(xù)圖）的例子,，用柱效的數(shù)學(xué)來解釋原理,。N=16(tR/W)2.其中tR是保留時(shí)間；W為峰寬,。
左圖：樣品質(zhì)量對峰寬和峰型的影響,峰1到峰4,，進(jìn)樣質(zhì)量逐漸增大。
右圖：樣品體積對峰寬和峰型的影響,峰1到峰4,，進(jìn)樣體積逐漸增大,。
上面的圖顯示，隨著樣品質(zhì)量和體積的增大,，W增大的程度遠(yuǎn)大于tR增量,，所以tR/W總比值是變小的，此比值與柱效呈正相關(guān),，所以柱效會(huì)下降,。
四、總結(jié)
通過上述的講解,，大家有沒有明白柱效為什么會(huì)降低呢,？有沒有體會(huì)到擁有“漁技”的快樂？有沒有內(nèi)心從容一些,？
色譜柱在出廠的過程中有專門優(yōu)化過的機(jī)器來進(jìn)行色譜柱測試性能,，各方面條件和現(xiàn)實(shí)中是有差異。所以新購來的柱子在實(shí)驗(yàn)室中所測得的柱效,，往往低于生產(chǎn)廠家給出的柱效,。
色譜柱測試時(shí)，可以根據(jù)廠家隨柱附帶的測試報(bào)告來測試,。當(dāng)然,，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的要求配制自己的標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)。
我們技術(shù)部建議：次柱測試,，*和廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)圖相比較,，選用與廠家相同的測試條件，有可靠的參考標(biāo)準(zhǔn),。
1. 常規(guī)HPLC色譜柱,，數(shù)值超過柱報(bào)告柱效上70%，則屬于合格品,。
2. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與進(jìn)樣體積,，請向廠家詢問清楚。
3. 測試物質(zhì)選取的不同,，作用也是不同的,。對于柱效這個(gè)參數(shù)，一般測定混合物的較靠后面的峰的數(shù)值作為比較標(biāo)準(zhǔn),。
4. 在HPLC儀器上測試內(nèi)徑小于3mm的色譜柱時(shí),，柱效這個(gè)數(shù)據(jù)已經(jīng)不準(zhǔn)確,，這個(gè)時(shí)候要關(guān)注出峰時(shí)間是否與柱報(bào)告上的物質(zhì)相近（管路長短、寬窄引起時(shí)間微小差異）,，峰是否變形,。*UHPLC儀器來測定UHPLC的小粒徑小體積柱。
