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氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒?說明書

  可見分光光度法 BC1180 ：50T/48S 試劑一：液體1瓶，50ml,，4℃保存,。 試劑二：液體1支，170μl,，4℃保存,。 試劑三：液體1瓶 60ml，4℃保存,。
試劑四：液體1瓶 8ml,，4℃保存。 試劑五：粉劑1支,，4℃保存,，用前8ml蒸餾水溶解。 試劑六：液體1支,，40μl,，用前0.8ml蒸餾水稀釋。 標準品：粉劑1支，10mg,，4℃避光保存,。 氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽,，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成,。GSSG會被谷胱甘肽還原酶還原成GSH，因此機體中大多數(shù)是以還原型形式存在,。測定細胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài)。本試劑盒利用谷胱甘肽能和5,，5’-二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（5,，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-巰基苯甲酸,，2-硝基-5-巰基苯甲酸在波長412nm處具有光吸收的特點,，通過2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽還原酶將GSSG還原為GSH,，借此測定氧化型谷胱甘肽的含量,。 分析天平、微量勻漿器（規(guī)格2ml）,、低溫離心機,、水浴鍋、移液器,、可見分光光度計,、1ml比色皿。
一,、 樣品的處理
（1）組織處理 新鮮組織先用PBS沖洗2次,，然后稱取動物組織或者植物組織0.1g。加入用試劑一潤洗過的勻漿器中（勻漿器提前放冰上預(yù)冷）,；然后加入1ml試劑一（組織/試劑一比例保持不變即可）,，迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃離心10min,；取上清液放置于4℃待測,，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）。 （2）血液處理 血漿：將收集的抗凝血于4℃,，600g離心10分鐘,，吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的試劑一,，4℃,，8000g離心10分鐘,，將上清移入新的試管中放置于4℃待測，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）,。
血細胞：將收集的抗凝血于4℃,，600g離心10分鐘,，棄去上層血漿用3倍體積的PBS清洗3次（用PBS重懸血細胞,，600g離心10分鐘），加入等體積試劑一,，混勻后4℃放置10分鐘,，8000g離心10分鐘，吸取上清放于4℃待測,，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）,。 （3）細胞處理 收集不少于108個細胞，先用PBS清洗細胞2次（PBS重懸細胞,，600g離心10分鐘）,，加入3倍細胞沉淀體積的試劑一重懸細胞，反復(fù)凍融2-3次（可在液氮中凍結(jié),，37℃水浴中溶解）,，8000g離心10分鐘，收集上清于4℃待測,，若暫時不能完成測試可放于-80℃保存（可保存10天）,。

二、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒實驗操作：
1,、分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長412nm，蒸餾水調(diào)零,。
2,、試劑二放置37℃（哺乳動物）或25℃（一般物種）水浴中保溫30min。
3,、標準品的稀釋：將標準品用1ml蒸餾水溶解(4℃保存),，濃度為10mg/ml。取適當溶液配制濃度為25μg/ml,、20μg/ml,、12.5μg/ml、6.25μg/ml,、3.125μg/ml,、0μg/ml的標準品（試劑一十倍稀釋后進行稀釋）。
4,、取1.5ml離心管,，加入100μL稀釋好的標準品或樣品,，加入2μL試劑二，混勻后37℃孵育30分鐘,。
5,、制作標準曲線
孵育完成后標準管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四,，100 μL試劑五,，10 μL試劑六，迅速混勻后,，測定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2,。吸光度（A2-A1）為橫坐標（x），濃度為縱坐標（y）做標準曲線,。
6,、樣品管依次加入700μL試劑三，100 μL試劑四,，100 μL試劑五,，10 μL試劑六，迅速混勻后,，測定412nm處30 s和150 s光吸收A1和A2,，△A= A2- A1。
三,、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒GSSG含量計算 根據(jù)標準曲線,，將樣品△A帶入公式中（x），計算出樣品濃度y（μg/ml）,。 （1）按蛋白濃度計算 GSSG（μg / mg prot）=y×V 反總÷V 樣÷Cpr =y×10.12÷Cpr （2）按樣本質(zhì)量計算 GSSG（μg /g）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)= y×10.12 ÷W （3）按細胞數(shù)量計算 GSSG（μg /104 cell）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量)= y×10.12 ÷細胞數(shù)量 （4）按液體體積計算 GSSG（μg / mL）= y×V 反總÷V 樣= y×10 V 反總：反應(yīng)總體積,，1.012mL；V 樣總：上清液總體積,，1 mL,；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL,；W：樣品質(zhì)量,，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,。
1、樣品處理需勻漿*,，若當天不能完成測量,，可放-80℃保存。
2,、若不確定樣品中GSSG含量的高低,，可稀釋幾個梯度后再進行測量,。
3、此方法利用酶促反應(yīng)速率計算底物濃度,，盡量準確在30秒和150秒處完成讀數(shù),。
4、因為試劑一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑,，因此上清液不能用于蛋白濃度測定,。