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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | D1100 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),石油 |
| 主要用途 | 本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞,根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DN |
質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書
貨號：D1100
規(guī)格：50T/100T
保存：常溫保存,，復(fù)檢期一年,。
試劑盒內(nèi)容
產(chǎn)品說明：
本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA,。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物,。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作,，包括酶切、PCR,、測序,、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇,，加入體積請參照瓶體上的標簽,。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入）,，混勻，置于 2-8℃保存,。如非指明,，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
質(zhì)粒小量提取試劑盒
操作步驟:
1,、取1-5ml細菌培養(yǎng)物,，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）,。
2,、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀,。注意：如果菌塊未*混勻,，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3,、向離心管中加入250ul溶液Ⅱ,，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和,，以免污染細菌基因組DNA,，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min,，以免質(zhì)粒受到破壞,。
4、向離心管中加入350ul溶液Ⅲ,，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次,，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀,。12000rpm離心10 min,，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀,。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混合,，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,，可再次離心后取上清,。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中）,，室溫放置2min,，12000rpm離心1min，倒掉收
集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中,。
6,、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min,，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中。
7,、向吸附柱中加入500ul漂洗液,，12000rpm離心1min，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。
8、12000rpm離心2min,，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘,，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切,、PCR等,。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中,，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液,，室溫放置2min，12000rpm離心1min,。
10,、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,，室溫放置2min,，12000rpm離心1min。
注意事項:
1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁,，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復(fù)澄清后再使用,。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子,。
2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul,，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍),， pH值低于7. 0會降低洗脫效率,， DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解,。
3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒,，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10ml過ye培養(yǎng)物,，同時按照比例增加溶液Ⅰ ,、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間,，以增加提取效率,。
4. DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān),。得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度,。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA,、 40ug/ml單鏈DNA,。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,，而使用去離子水,，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值,，但并不表示純度低,。
相關(guān)產(chǎn)品：
E1020 EB染色液
D1010 6×DNA Loading Buffer
T1060 50×TAE 緩沖液
T1050 5×TBE 緩沖液
M1070 D2000 plus DNA Ladder
M1400 1kb DNA Ladder
G8142 GoldView II型核酸染色劑(5000×）
相關(guān)文獻：
《A rapid and efficient one-step site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis protocol》 作者:Deguang Wu，Xuewu Guo,，Jun Lu,，Xi Sun，F(xiàn)eng Li,，Yefu Chen,，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23256925
《Enhanced freeze tolerance of baker’s yeast by overexpressed trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough》 作者:Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,Haiyan Xu,Cuiying Zhang,Dongguang Xiao 期刊:Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 影響因子:2.533 PMID:24951963
《A two-step integration method for seamless gene deletion in baker’s yeast》 作者:Jian Dong，Guanglu Wang,，Cuiying Zhang,，Haigang Tan，Xi Sun,，Mingyue Wu,，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23597844
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