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IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 基因工程：IPTG為安慰性誘導(dǎo)物,，X-gal為生色底物,，二者共同用于藍白斑篩選,。IPTG可誘導(dǎo)載體lac操縱子DNA區(qū)段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，該片段可與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補(α互補),。實現(xiàn)α互補的細(xì)菌暴露IPTG,，鋪在含有X-gal生色底物的培養(yǎng)基上，可形成藍色菌落,。外源DNA插入質(zhì)粒的多克隆位點后可破壞α互補作用,將產(chǎn)生白色菌落,。

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用*的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,，因此被實驗室廣泛應(yīng)用,。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo),。在這個操縱子（元）體系中,，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進入細(xì)胞,，經(jīng)b－半乳糖苷酶催化,，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白,，使蛋白構(gòu)象變化,，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄,。

材料

1,、誘導(dǎo)表達材料

( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培養(yǎng)基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用范圍：大腸桿菌

( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,，分裝成1 mL /份,，－20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳級）

0.1 ％ 溴酚藍

10 ％ 甘油

2,、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L PMSF

（3）10 mg / mL 溶菌酶,。

（4）脫氧膽酸。

（5）1 mg / mL DNase I,。2 ）超聲破碎法

( 1 ) TE 緩沖液,。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％ 溴酚藍

20 ％ 甘油

IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 基因工程實驗方案

1、外源基因的誘導(dǎo)表達

( 1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因,。

( 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體,，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。

( 3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜,，DNA 序列測定確定無誤后進行下一步。

( 4 ）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子,，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時,，使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ,；如果表達載體的原核啟動子為tac 等,，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ,。

( 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心,，1 min ，沉淀,，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,，作SDS -PAGE 檢測。

2,、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

1 ）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法,；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法,；④ 酶溶法,；⑤ 化學(xué)滲透等,。前三種方法屬機械破碎法，并且方法① ,、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,，后三種方法在實驗室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟,。

（1）酶溶法,。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶,；β-1,6 -葡聚糖酶,；蛋白酶；殼多糖酶,；糖昔酶等,。溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著,。

IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 基因工程主要步驟為：

① 4 ℃ ,，5000rpm 離心，15 min ,，收集誘導(dǎo)表達的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL ）,。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液,，懸浮沉淀,。

注意事項：培養(yǎng)噬菌體時，Top agar中的添加量為：25 μl/3 ml(24 mg/ml),。含有IPTG的培養(yǎng)基4℃避光保存,，須在1~2 周內(nèi)使用。

保存：IPTG要2-8°C冷藏保存,，配制好后保存于-20°C,，室溫可放置一個月。遠離熱源及氧化劑,。