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Omega-質(zhì)粒提取試劑盒

操作步驟： 

使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無水乙醇,，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽,。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA全部加入），混勻,，置于 2-8℃保存,。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式

離心機(jī)在室溫下離心,。 

1,、取1-5ml酵母培養(yǎng)物（不超過 5×107cells），12000rpm離心 1min,，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）,。 

2、酵母細(xì)胞壁的破除： 

A,、酶法：向酵母菌體中加入 470ul 山梨醇 Buffer,，充分懸浮菌體,，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul β-巰基乙醇，充分混勻,，30℃處理 1-2h,，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm 離心 1min,，棄上清,，收集沉淀。向沉淀中加入 250ul 溶液 YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA） ,，充分懸浮沉淀,。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低,。 

B,、玻璃珠法：向酵母菌體中加入 250ul 溶液 YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA） ，充分懸浮沉淀,。加入 150-200ul酸洗玻璃珠（自備）,，漩渦振蕩 10min。簡(jiǎn)短離心使玻璃珠沉降到離心管底,，吸取上清（如上清有所損失,，請(qǐng)用溶液 YP1 補(bǔ)足 250ul）于另一干凈離心管中,。 

3,、向離心管中加入 250ul溶液 YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解,。注意：混勻一定要溫和,，以

免污染細(xì)菌基因組 DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠,，作用時(shí)間不要超過 5 min,，以免質(zhì)粒受到破壞。 

4,、向離心管中加入 350ul溶液 YP3,，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8次，充分混勻,，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀,。12000rpm離心 10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,，盡量不要吸出沉淀,。注意：溶液 YP3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀,。如果上清中還有微小白色沉淀,，可再次離心后取上清。 

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中,，室溫放置 2min,，12000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液,，吸附柱重新放回收集管中,。 

6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),，12000rpm 離心 1min,，棄廢液，將吸附柱放入收集管中,。 

7,、向吸附柱中加入 500ul漂洗液，12000rpm離心 1min,，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中。 

8,、12000rpm 離心 2min,，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切,、PCR 等。 

9,、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 2min,，12000rpm離心 1min,。 

10、為了增加質(zhì)粒的回收效率,，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,，室溫放置 2min， 12000rpm離心 1min,。  

注意事項(xiàng)： 

1,、使用前請(qǐng)先檢查溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象,，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。 

2,、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul,，體積過小影響回收效率,；洗脫液的 pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)此范圍),，pH 值低于 7.0 會(huì)降低,。洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,，以防 DNA降解,。 

3、質(zhì)粒得率與酵母菌株,、質(zhì)?？截悢?shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān),。通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，一般通過電泳或分光光度計(jì)法都很難檢測(cè)到,，可通過 PCR或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來檢測(cè),。 

4、DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的基因組DN**段的大小與樣品保存時(shí)間,、操作過程中的剪切力等因素有關(guān),。回收得到的DN**段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度,。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰,， OD260值為 1 相當(dāng)于大約 50  μg/ml雙鏈DNA、40  μg/ml單鏈DNA,。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9,，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,，而使用去離子水,，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值,，但并不表示純度低,。 

Omega-質(zhì)粒提取試劑盒